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目的探索凋亡在肺缺血再灌注损伤中的作用机制,对PFC的生物学保护效应及可能的机制有更深入的理解和阐释,为临床应用PFC治疗LIRI提供较为客观和更充分的理论依据,以期有效改善供体肺保护,研究改良新的供体肺保存液,为临床肺移植手术和体外循环手术地应用提供更大范围的保障。方法1.建立肺缺血再灌注的细胞模型。A549细胞在不同的时间(6h、12h)被保存于100%氧气及4℃的环境中,并加入低钾右旋糖酐培养以模拟缺血的过程。继而转入放有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基的温暖环境(37℃)孵育2h以模拟再灌注情况。2.PFC对IRI诱导的A549凋亡损伤的保护作用。应用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率化及western blotting法检测caspase-3蛋白的表达。将培养传代的第三、四代A549细胞分为四组:①对照组(control group)组:不作任何干预;②IRI组:仅缺血再灌注处理;③PFC(全氟辛烷)组:按30%体积比(PFC:培养液)在细胞培养中加入全氟辛烷;④PFC+IRI组:按30%体积比(PFC:培养液)在缺血再灌注阶段加入全氟辛烷。FCM缺血阶段时间取6h和12h两个时间点的样本。结果1.细胞凋亡的FCM结果:肺缺血再灌注条件作用于A549细胞6h和12h后的早期细胞凋亡率分别为10.01%和14.21%;晚期凋亡和坏死率分别为4.93%及5.49%;细胞存活率分别为84.61%与79.59%。即随着时间的推移,细胞凋亡坏死率逐渐上升,而其细胞存活率逐渐下降。与对照组、PFC组和共培养组比较,IRI作用于A549细胞后的6,12h,其早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡和坏死率显著升高,存活率显著下降,且12小时明显重于6小时;与对照组比较,PFC两个时相组的细胞凋亡率和存活率的差异无统计学意义,且两组之间差异也无统计学意义;与对照组和全氟化碳组比较,PFC+IRI组A549细胞的12h早期凋亡率升高,存活率下降,即PFC能明显拮抗缺血再灌注诱导的凋亡作用,但不能完全阻断缺血再灌注对细胞的促凋亡效应。2. western blotting结果:IRI作用于A549细胞0.5,2,6,12h见caspase-3前体降解的17 kDa和11 kDa两个活性片段;PFC单独作用于A549细胞,该蛋白的活性和水平无明显影响;于PFC+IRI组, caspase-3蛋白的活性显著下降,提示PFC能够显著抑制IRI诱导的此蛋白的激活进而阻断IRI的诱导细胞凋亡的效应。结论1.缺血再灌注作用于A549细胞可诱导其发生凋亡的损伤改变,这种效应呈时间依赖。2.PFC单独作用于A549细胞,不诱导其凋亡损伤的发生,当PFC加入缺血再灌注条件下孵育A549细胞时,则可以显著减轻缺血再灌注诱导的A549细胞凋亡的损伤,增加细胞的存活率。