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骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)是成体骨髓细胞中除造血干细胞之外的另一类骨髓干细胞,近年来的研究证明其具有多向分化的潜能,包括向神经干细胞转化,并可进一步分化为神经元和神经胶质细胞。体外诱导BMSCs向神经细胞分化最终的目的在于应用,目前已有很多研究在体外培养扩增BMSCs并诱导其向神经细胞分化。但关于分化后细胞表型稳定的研究还未见文献报道。目的:研究骨髓基质细胞体外分离培养方法,找出诱导BMSCs向神经细胞分化的优化方案,观察BMSCs诱导后细胞表型的稳定,旨在为BMSCs将来的应用做基础性研究。方法:(1) 选用绿色荧光(GFP)小鼠作为研究对象,分离培养骨髓基质细胞(BMSCs),并在体外进行细胞扩增和传代。(2) 应用诱变剂维甲酸(RA)和β巯基乙醇(BME),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),二甲亚砜(DMSO),神经生长因子(NGF)和脑源性生长因子(BDNF),联合作用对GFP小鼠BMSCs进行诱导。在其它诱导条件不变的前提下,对比含有不同浓度RA和BME的诱导剂,对GFP小鼠BMSCs诱导后分化为神经细胞比例的影响。于诱导后对细胞表达神经微丝蛋白(NF-200),胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP),神经元烯醇化酶(NSE)和纤维结合素(fibronectin)的结果进行免疫荧光和免疫组化的检测。计算阳性细胞比例,统计分析。选出合适的诱导剂。(3) 对比不同诱导时间对GFP小鼠BMSCs分化为神经细胞比例的影响。通过免疫荧光和组化的方法进行检测,并计算阳性细胞比例,统计分析。找出合适的诱导时间。(4) 诱导后换液去除诱导剂成分,再加入脑匀浆上清液,免疫荧光和组化检测其对细胞表型稳定性的影响。 结果:(1) GFP小鼠BMSCs分离后可在体外培养条件下生长增殖并传代。培养3代后可形成形态均一的细胞,连续传代10代后仍可保持旺盛分裂能力,说明骨髓基质细胞具有良好的体外培养和体外扩增的能力。(2) 用含浓度0.25μM～5.0μM RA的诱导剂进行诱导时,随所RA浓度增高,NF-200,GFAP和NSE阳性细胞比例也呈现逐步增高趋势,同时随RA浓度增高fibronectin阳性细胞比例则呈下降趋势。用免疫荧光方法检测RA浓度为1.0μM时<WP=8>BMSCs分化为NF-200和NSE阳性细胞比例为20.5%±3.4%和22.1%±3.0%,显著高于对照组(P<0.05)。用含浓度0.25mM～5.0mM BME的诱导剂进行诱导时,GFAP阳性细胞比例随BME浓度增高变化不明显,免疫荧光方法得到BME浓度达到0.5mM时能够诱导NF-200和NSE阳性细胞比例为32%±4.1%和40.3%±3.7%,与对照组差异显著(P<0.01)。1.0μM RA和0.5mM BME联用时,免疫荧光方法NF-200,GFAP和NSE阳性细胞比例分别为42.4%±3.5%,36.2%±2.6%和39.3%±1.8%。RA和BME联用时NF-200和NSE阳性细胞比例显著高于RA单用(P<0.05),RA和BME联用时NF-200和GFAP阳性细胞比例显著高于BME单用时(P<0.05)。所以RA和BME联用能够以较低的诱导剂浓度得到较明显的诱导效果。平行实验中免疫组化方法所得结果与免疫荧光所得结果一致。(3) 诱导时间3h～3d,随诱导时间增加,NF-200,GFAP和NSE阳性细胞的比例也呈现出逐步增高。诱导时间为8h时免疫荧光所得BMSCs分化为NF-200,GFAP和NSE阳性细胞比例为18.5%±4.2%,19.7%±2.4%和20.5%±3.1%,显著高于对照组(P<0.05)。应用免疫组化得到的结果为12h。(4) 诱导后换液,去除诱导剂成分后维持1d～7d,对照组中,换液7d后NF-200,GFAP和NSE阳性细胞比例与换液1d相比均显著下降(P<0.05),同时fibronectin阳性细胞比例则升高(P<0.05)。加入脑匀浆上清组,换液3d和7d后NF-200,GFAP和NSE阳性细胞比例均显著高于对照组(P<0.05)。对比加入脑匀浆上清7d和1d,7d后NF-200,GFAP和NSE阳性细胞比例与1d相比无显著差异(P>0.05),而fibronectin阳性细胞比例则低于1d(P<0.05)。结论:(1) RA,BME,bFGF,DMSO,NGF和BDNF联合作用可以诱导GFP小鼠BMSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化。1.0μM RA加0.5mM BME能够以较低的诱变剂浓度获得较明显的诱导BMSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化的效果。(2) 诱导8～12h后BMSCs可有效向神经细胞和神经胶质细胞分化。(3) 脑匀浆上清液有维持诱导后细胞表型稳定的作用。以期为临床获取自体BMSCs,进行体外扩增培养并诱导其向神经细胞分化,再将已分化的细胞导入体内让其发挥生物学作用的干细胞技术,应用于治疗临床神经系统疾病,提供可靠的理论依据和实验佐证。