手性醇类化合物是有机合成中常用的重要合成砌块，可以用来制备多种手性药物、农用化学品和精细化学品等。潜手性酮的不对称还原是制备这类化合物的重要策略之一。其中生物催化不对称还原法相比经典化学方法而言，具有理论产量高、选择性好、副产物少、环境污染小和反应条件温和等优点，已经发展成为绿色合成的优选途径。羰基还原酶在自然界中分布广泛，适用于结构多样的化合物的还原。本研究针对几类目前多采用化学催化实现不对称还原的手性药物关键中间体，通过筛选本实验室的羰基还原酶工具箱，寻找高活性和高立体选择性的酶，并利用蛋白工程技术对其性能进行改造，为其工业化应用奠定基础。本课题主要研究内容如下:　　第一部分，N-杂环酮类化合物的立体互补性不对称还原。光学纯的饱和N-杂环醇类化合物，是许多天然产物和药物合成的重要砌块。而文献报道的生物催化不对称还原制备N-杂环醇类化合物的酶较少，且这些酶大部分都遵循Prelog法则，导致产物立体构型比较单一。我们以N-Boc-3-吡咯酮为底物成功筛选了两个具有立体互补性的羰基还原酶，其中READH遵循Prelog法则，可用于制备S-构型的醇，而ChKRED20则遵循anti-Prelog法则，可用于制备R-构型的醇，产物光学纯度均可达到＞99％ee。这两个酶都可以利用廉价的异丙醇为辅底物，可实现高效、经济的自身辅酶循环，同时可抑制粗酶液中杂蛋白的催化活性。READH和ChKRED20都具有较广的底物谱，底物浓度200mM情况下，可以催化多种五元、六元和七元环酮的结构类似物，得到立体互补的S-醇和R-醇，绝大多数产物可达到＞99％ee。　　第二部分，定向进化提高羰基还原酶READH的热稳定性和异丙醇耐受性。第一部分研究中发现READH虽然可以利用异丙醇作为辅底物，但是对其耐受性较差，是工业化应用的重要限制性因素，而定向进化是当前公认的改善这一问题的有效途径。因此我们构建了READH的随机突变文库，以N-Boc-3-哌啶酮为底物，就活性、热稳定性和溶剂耐受性这几个方面进行了高通量筛选，获得了9个性能提升的突变子。将关键的有益位点进行整合后，获得了催化性能大幅提高的突变体M09。与野生型相比，突变体M09的活性提高了三倍，产物光学纯度保持＞99％ee;其最适反应pH从6.5改变为9.0。突变体M09的稳定性也大幅提升，在50℃热处理21h后残余活性仍大于99％，在60℃的热失活半衰期(t1/2)为9h，而野生型在60℃下t1/2仅为10min。突变体M09的酶活力具有热激活效应，其粗酶液在60℃热处理30min后，催化活力可提高两倍;在最优反应条件下，可以在16h内完全转化150g/L的底物，获得光学纯的S-醇。　　第三部分，N-杂环-β-酮酯类化合物的动态动力学还原。光学纯的N-杂环-β-醇酯类化合物含有两个手性中心，是一类重要的手性合成砌块。目前已报道的生物催化在此类化合物合成中的应用很少，且这些反应均利用酵母细胞进行催化。而利用异源过表达的羰基还原酶往往可显著提高酶的催化效率和立体选择性。我们以1-苄基-3-乙氧羰基-3-哌啶酮和1-苄基-3-乙氧羰基-4-哌啶酮为底物成功筛选到具有高催化活性和立体选择性的短链脱氢酶ChKRED26。该酶的辅酶偏好性为NADPH;最适反应温度为40℃;最适反应pH为8.0。在最优反应条件下，利用葡萄糖脱氢酶进行辅酶循环，可以在16h内完全转化100mM的底物1-苄基-3-乙氧羰基-4-哌啶酮，获得高光学纯度的(3R，4S)-醇(＞99％ee，dr97/3)。　　第四部分，α-烷氧基-β-酮酯类化合物的动态动力学还原。手性的1，2-二醇及其衍生物是很多天然化合物的重要合成砌块，目前多用化学。我们以2-甲氧基-3-羰基苯丙酸乙酯成功筛选到具有高催化立体选择性的短链脱氢酶ChKRED12。该酶的辅酶偏好性为NADPH;最适反应温度为40℃;最适反应pH为8.0;可高立体选择性还原潜手性酮衍生物，具有较宽泛的催化底物谱，获得(2S,3S)-醇，绝大多数产物的ee值＞99％、dr值＞95/5。　　第五部分，ChKRED12的性能优化及立体选择性反转。为提升ChKRED12的催化性能和适用范围，我们利用半理性设计的策略对其进行了分子改造。基于同源建模和分子对接结果，选取活性中心可能的关键氨基酸残基建立单点饱和突变文库，以2-甲氧基-3-羰基苯丙酸乙酯为底物，通过高通量筛选方法获得立体选择性反转的突变体Q151F和Q151Y，以及催化活性提高四倍的突变体M191S。与野生型ChKRED12相比，突变体M191S立体选择性也得到优化（产物＞99％ee，dr＞99/1)。进一步对151和191位点进行整合，获得了立体选择性反转且活性提高的组合突变体Q151F/M191S和Q151Y/M191S。与野生型ChKRED12相比，突变体Q151F/M191S和Q151Y/M191S的活性提高了三倍左右。通过分子对接逆向分析，突变位点的引入确实改变了酶与底物分子之间的空间位阻和分子间作用力，证实其在改造酶的催化活性和立体选择性中发挥的重要作用。　　综上所述，本研究以潜手性的N-杂环酮和β-酮酯类化合物为底物，通过对本实验室的羰基还原酶工具箱进行筛选，获得了高活性和高立体选择性的酶，丰富了该酶库的底物谱。并将定向进化及半理性设计应用于羰基还原酶READH和ChKRED12的分子改造，获得了若干功能改进的突变体，促进了该酶在多种手性药物中间体合成中的工业化应用。