【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis）是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,以细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在肝内过多沉积为特征。肝纤维化为一动态过程,属可逆性病变,因此,阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要目标。既往认为,肝纤维化发生的中心环节是肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）激活并向肌成纤维样细胞（myofibroblasts,MFs）转化,抑制HSC激活、增殖与迁移、诱导凋亡是肝纤维化治疗的重要策略。近年来研究发现,在静息状态下,HSC可能是一种上皮细胞,对肝干细胞的分化和增殖以及肝细胞功能维持均起重要作用。此外也有研究显示,肝实质细胞如肝细胞以及胆管上皮细胞均可能转化为MFs,参与肝纤维化的发生发展。因此,抑制HSC活化和增殖可能不是治疗肝纤维化的最好策略,迫切需要针对肝纤维化发病的新机制重新确立新的有效治疗方法。上皮细胞间质转型（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）主要是指上皮细胞在细胞形态、细胞结构、细胞功能以及细胞粘附、迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。目前,EMT在肝脏、肾脏、肺脏等器官纤维化进程中的重要作用已经得到证实。一系列研究也表明,肝细胞、HSC、胆管上皮细胞也通过EMT转化为MFs,参与肝纤维化进程。这些研究重新认识了肝脏实质细胞和间质细胞作用,是肝纤维化机制与治疗领域新的突破。肝细胞核因子4（hepatocyte nuclear factor,HNF4）是一种属于细胞核激素受体家族的转录因子,在分化成熟的肝细胞中高表达,其中HNF4α是HNF4的重要亚型。HNF4α参与维护肝细胞脂肪代谢、白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成等重要功能,也是调控上皮细胞表型（如紧密连接、粘附连接、缝隙连接、桥粒以及细胞与细胞基质间粘附分子、上皮细胞极性和细胞骨架蛋白等）表达的重要基因。晚近研究发现,TGF-β1可诱导小鼠肝细胞发生EMT并伴有HNF4α表达下调;上调HNF4α表达可阻断EMT重要转录因子Snail基因诱导的肝细胞EMT发生;上调间质细胞NIH-3T3中HNF4α表达可使其向上皮细胞转型（mesenchymal-to-epithelial transition,MET）,表明HNF4α对EMT有重要的调控作用。基于以上研究结果我们推测,HNF4α将可能阻断肝纤维化进程中肝细胞通过EMT转化为MFs,从而维持其上皮细胞表型和肝细胞功能。更为重要的是,上调HNF4α基因在HSC中表达,将可能促使活化HSC向上皮细胞表型转化,从而达到既抑制活化HSC的问质细胞特性,又发挥其促进肝脏再生和肝干细胞分化的作用。本课题在明确肝纤维化进程中HNF4α表达下降的基础上,将携带HNF4α的重组腺病毒—AdHNF4α经尾静脉注射导入肝纤维化大鼠体内,明确上调HNF4α基因表达对实验性肝纤维化的抑制作用;通过上调经TGF-β1刺激后原代培养肝细胞和活化HSC HNF4α的表达,检测上述细胞EMT相关基因和生物学功能变化,阐述HNF4α通过阻断EMT进而抑制肝纤维化的作用机制,为肝纤维化的发病机制和治疗研究提供新的思路。【实验方法】一、HNF4α抑制肝纤维化进程中EMT的体内研究1.利用AdEasy^TM系统构建表达HNF4α的重组腺病毒—AdHNF4α,293细胞包装并反复感染,扩增高效表达HNF4α的AdHNF4α和空白对照病毒AdGFP,浓缩纯化、测定滴度后保存。2.AdHNF4α抑制DMN损伤大鼠的肝纤维化进程将雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠随机分为4组,第1组为正常对照组（n=10）;2-4组为肝纤维化模型组,予1%二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine,DMN）以10μg/kg腹腔注射,每周连续注射3次,共注射5w。其中第2组设为模型对照组（n=30）,第3组为AdGFP导入组（n=10）,第4组设为AdHNF4α导入组（n=10）。分别在第2w、4w处死模型组大鼠各10只。于DMN注射4w后AdHNF4α组和AdGFP组分别经尾静脉导入4×10⁹ pfu/只AdHNF4α或4×10⁹ pfu/只AdGFP,注射病毒2w后处死大鼠,分别观察各组大鼠肝功能指标及凝血酶原时间（prothrombin time,PT）变化;免疫组织化学法测定肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达;HE和VG染色测定ECM含量并对肝纤维化程度分级,图象分析仪半定量分析。3.AdHNF4α对胆管结扎（bile duct ligation,BDL）大鼠肝纤维化进程的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为4组,每组12只,分设假手术组、胆总管结扎组、空白病毒AdGFP导入组和AdHNF4α导入组。钝性分离并结扎胆总管,制备BDL肝纤维化模型。术后2d AdGFP组和AdHNF4α组分别经尾静脉导入4×10⁹ pfu/只AdGFP或4×10⁹ pfu/只AdHNF4α;3w后处死大鼠,观察指标同DMN模型。4.Real time RT-PCR和免疫组织化学方法,分别检测正常、DMN肝损伤2w和4w大鼠肝组织HNF4α及EMT相关基因的表达;同时检测HNF4α导入后HNF4α及EMT相关基因的表达,评估对实验性肝纤维化的抑制效果。二、上调HNF4α表达对肝细胞EMT的作用分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时将AdGFP或AdHNF4α以感染复数（multiplicity of infection,MOI）10感染肝细胞,动态观察细胞形态变化;收集感染48h、72h后细胞,抽提总RNA和蛋白。Real time RT-PCR法检测肝细胞HNF4α、白蛋白（albumin,ALB）、谷胺酰氨合成酶（glutamine synthetase,GS）、细胞色素P450家族1A2（c）rtochrome P4501A2,CYP1A2)、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail、Ⅰ型胶原mRNA水平表达。三、上调HNF4α表达对HSC细胞表型和生物学活性的影响AdGFP或AdHNF4α分别以MOI 50感染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,动态观察细胞形态变化;收集感染后48h、72h细胞,抽提总RNA和蛋白。Real time RT-PCR法检测细胞HNF4α、ALB、GS、CYP1A2、E-cadherin、Vimentin、Snail、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、组织金属蛋白酶抑制-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）基因mRNA水平表达变化;细胞免疫荧光方法检测HNF4α、Vimentin表达;绘制感染前后细胞增殖曲线。四、统计学处理数据采用SPSS 11.0统计软件包进行分析,结果以（?）±S表示。多组间采用One-WayANOVA分析,方差非齐性则采用非参数检验;P＜0.05为具有显著性差异,P＜0.01为具有非常显著性差异。【实验结果】一、HNF4α体内导入对实验性肝纤维化的抑制作用1.DMN损伤肝纤维化进程中EMT相关基因表达变化:Real time RT-PCR检测DMN注射2w和4w大鼠肝组织中HNF4α和上皮细胞表型基因E-cadherin mRNA水平表达较正常组明显降低（P＜0.05）,同时肝细胞功能基因白蛋白mRNA水平表达也明显下调（P＜0.01）;而间质细胞表型基因Snail、Vimentin表达均较正常组明显增加（P＜0.05）。2.HNF4α对DMN肝纤维化模型的抑制作用:HNF4α基因导入组血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）及PT值分别为113.2±21.6 U/L、23.8±1.41s,较模型对照组（163.8±19.4 U/L、29.4±1.63 s）和AdGFP组（165.2±27.1 U/L、27.4±1.96s）明显降低（P＜0.05）;HNF4α基因导入组肝组织羟脯氨酸含量为217.16±42.51μg/g,较模型对照组（341.07±81.20μg/g）和AdGFP组（361.37±112.83μg/g）明显减少（P＜0.05）。HNF4α组胶原染色面积约为AdGFP组的49%（P＜0.05）,免疫组化表明Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达较AdGFP组均显著下降（P＜0.05）。3.HNF4α对BDL模型肝纤维化的抑制作用:HNF4α基因导入组血清ALT、AST分别为86.4±13.9U/L、523.6±90.0 U/L,较AdGFP组（127.8±13.9 U/L、726.8±129.7 U/L）有明显差异（P＜0.05）;治疗组胶原染色面积约为AdGFP组的52%（P＜0.05）,免疫组化表明Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达较AdGFP组均显著下降（P＜0.05）。4.HNF4α对DMN损伤肝纤维化模型肝组织ALB和EMT相关基因表达影响:AdHNF4α导入组ALB和E-cadherin mRNA表达较AdGFP导入组及模型组显著增加（P＜0.01）,而Snail、Vimentin表达均显著减少（P＜0.05）。二、HNF4α对TGFβ1诱导原代培养肝细胞EMT的影响1.将含有TGF-β1无血清培养基刺激原代大鼠肝细胞24 h后,肝细胞形态无明显变化;48 h后可见较多死亡细胞,细胞数量减少,形态由多边形向梭形转变;72 h后见死亡细胞进一步增多,活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态。Realtime RT-PCR检测Vimentin、Snail、Ⅰ型胶原表达均明显增强（P＜0.05）,而E-cadherin、HNF4α、ALB、GS、CYP1A2表达明显减少（P＜0.05）。2.将MOI 10的AdHNF4α和AdGFP分别感染TGF-β1刺激的原代大鼠肝细胞,24 h后,两组在细胞数量和细胞形态上无明显差别,荧光显微镜下均可见大量GFP表达;48 h后AdHNF4α组细胞死亡数量较AdGFP组明显减少,细胞形态仍保持多边形:72 h后AdGFP组活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态,AdHNF4α组细胞死亡细胞很少且大多仍保持多边形形态。Real time RT-PCR检测AdHNF4α组HNF4α表达明显上调,Vimentin、Snail和Ⅰ型胶原表达均明显减少（P＜0.05）,E-cadherin明显增加（P＜0.05）,肝细胞功能基因ALB、GS、CYP1A2表达明显增强（P＜0.05）。三、HNF4α对HSC细胞表型和生物学活性的影响1.将AdHNF4α以MOI 50滴度感染肝星状细胞株HSC-T6 48 h和72 h后AdHNF4α组Vimentin、Snail、Ⅰ型胶原、α-SMA和TIMP-1 mRNA水平均明显下降（P＜0.05）,E-cadherin表达明显增加（P＜0.05）,GS和CYP1A2等肝细胞功能基因明显增强（P＜0.05）;72h后AFP mRNA及HNF4α蛋白表达明显增加,Vimentin蛋白表达减弱。2.MTS法连续5d测定OD₄₅₀值,发现HNF4α导入HSC-T6后,细胞增殖明显抑制,第4d OD₄₅₀值为0.9761±0.1151,增殖活性显著低于对照组（阴性对照组1.4427±0.1567,AdGFP组1.3403±0.1120,P＜0.01）。【结论】1.肝纤维化进程中,肝细胞HNF4α表达逐渐降低。2.AdHNF4α体内基因导入可明显抑制大鼠肝脏ECM沉积,促进肝功能恢复,是治疗实验性肝纤维化新的有效方法。3.HNF4α基因导入大鼠肝细胞后可阻断TGF-β1诱导的EMT,维持肝细胞正常表型,增强肝细胞功能。4.HNF4α基因导入可使活化HSC向上皮细胞转型,并抑制其MFs生物学功能。5.HNF4α治疗肝纤维化的主要机制是抑制肝细胞和HSC的EMT,恢复纤维化肝脏中肝细胞功能,并抑制活化HSC生物学活性。