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由于干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能,对于研发有效的抗病毒生物制剂及增强疫苗效果的佐剂具有重要的意义。本研究利用基因工程技术,以吉林白鹅α/γ干扰素基因(JGIFN-α/γ)为研究对象,对其进行了克隆、表达及抗病毒活性研究。同时为了进一步研究JGIFN-γ作为佐剂的免疫增强作用,成功构建了带有分子免疫佐剂JGIFN-γ的GPV-VP3基因疫苗并对雏鹅进行了免疫,为研发高效的鹅细小病毒基因疫苗奠定了基础,本研究具体进行了以下几方面的工作：1、吉林白鹅α干扰素成熟肽原核表达及抗病毒活性的研究参照已克隆得到的JGIFN-α完整的ORF基因序列设计了一对特异性引物,克隆得到了编码α干扰素的成熟肽基因(mJGIFN-a)。利用pET28a (+)作为原核表达载体,成功构建了吉林白鹅α干扰素基因的原核表达质粒pET-mJGIFN-a。将该重组表达质粒转化入E.coli Rossetta菌中进行了表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE和western-blot分析表明获得了分子量为22ku的包涵体蛋白。将包涵体蛋白经Ni-IMAC亲和层析法纯化及稀释透析复性后,得到了与预期结果一致nJGIFN-a重组蛋白。采用微量细胞病变抑制法分析mJGIFN-a重组蛋白的抗病毒活性,表明其抗病毒活性为7.9×102U/mL,比活性为1.3×103U/mg。同时通过FQ-PCR方法研究动态检测抗鹅细小病毒(GPV)的生物活性,结果发现该重组蛋白能够抑制GPV的复制,具有明显的抗病毒活性,为制备应用于临床上的抗病毒生物制剂研究提供了科学依据。2、吉林白鹅γ干扰素基因序列分析、原核表达及抗病毒活性采用RT-PCR的方法从吉林白鹅外周血单核细胞中扩增得到了Y干扰素基因(JGIFN-γ),构建了重组克隆质粒pMD-JGIFN-γ。利用生物信息学软件及在线分析软件对JGIFN-γ基因的核酸及氨基酸序列进行了分析。分析13个不同动物的相关基因结果表明JGIFN-γ与同为水禽的鸭、鹅的核苷酸和氨基酸同源性均高于90%,在进化树上位于同一分支。JGIFN-γ蛋白含有4个潜在的疏水区、3个N-糖基化位点、10个磷酸化位点。对其亚细胞定位预测结果为大部分蛋白分布于在细胞核内,其余分别在线粒体、细胞质、质膜上、内质网上、高尔基氏体及细胞外,为进一步研究γ干扰素蛋白的功能特性提供了理论依据。二级结构预测结果显示该肽链主要由α-螺旋组成,包括4个抗原指数较高的抗原表位,表明γ干扰素具有良好的抗原性,为进一步研究其作为分子佐剂提供了理论依据。同时成功的构建了原核表达质粒pET-JGIFN-γ,获得了JGIFN-γ重组蛋白,将该重组蛋白经Ni-IMAC亲和纯化及稀释透析复性后,采用微量细胞病变抑制发分析其抗病毒活性,结果表明其抗病毒活性为1.9×102U/mL,比活性为4.3×102U/mg,为研究γ干扰素蛋白的生物学活性提供了科学依据。3、吉林白鹅IFN-γ及其与VP3融合基因核酸疫苗的制备与表达研究通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)技术得到包含了缺失TAA终止密码子的JGIFN-γ基因和缺失了ATG起始密码子的VP3的融合基因JGIFN-γ-VP3,两个基因之间由高亲水性氨基酸Gly-Gly-Gly-Ser编码的核苷酸连接起来。分别将JGIFN-γ和JGIFN-γ-VP3融合基因通过基因重组技术正向插入到pVAX1CMV启动子下游BamHI和HindⅢ酶切位点之间,成功构建了真核重组表达质粒pVAX-JGIFN-γ和pVAX-JGIFN-γ-VP3。利用脂质体介导法将其转入Vero细胞中,通过间接免疫荧光技术和RT-PCR技术证实JGIFN-γ基因和JGIFN-γ-VP3融合基因在Vero细胞中获得了表达,为进一步研究γ干扰素基因作为基因疫苗的分子佐剂奠定了基础。4、GIFNγ-VP3真核表达质粒对雏鹅的免疫研究为研究真核重组表达质粒pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3/pVAX-JGIFNγ-VP3免疫调节特性,将不同剂量pVAX-JGIFN-γ-VP3质粒和不同剂量pVAX-JGIFN-γ质粒与pVAX-VP3质粒联合使用免疫28日龄鹅。同时设pVAX-VP3质粒免疫组、小鹅瘟弱毒疫苗、pVAX1、生理盐水对照组。对不同时间点鹅外周血淋巴细胞增殖试验的结果表明,pVAX-JGIFN-γ-VP3基因免疫组细胞免疫水平高于pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3基因疫苗免疫组,同类疫苗中且呈现剂量相关性。分子佐剂基因疫苗免疫组显著高于pVAX-VP3基因疫苗免疫组但显著低于GPV弱毒疫苗组(P<0.05)。间接ELISA方法检测鹅体内IgG动态变化规律结果表明,pVAX-JGIFN-γ-VP3和pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3所诱导的体液免疫的抗体水平,明显高于pVAX-VP3单基因疫苗免疫组(P<0.05),但显著低于GPV弱毒疫苗组(P≤0.05)。同时采用微量血清中和抗体试验检测了各组疫苗免疫后所诱导的中和抗体水平结果表明,各基因疫苗和GPV弱毒株均能较长时间诱导雏鹅产生针对GPV的中和抗体,含分子佐剂GPV-VP3基因疫苗的中和抗体水平比不含佐剂的GPV-VP3基因疫苗组高；而注射pVAX1和生理盐水的对照组均不能保护GPV对鹅成纤维细胞的感染,说明了DNA基因疫苗和GPV弱毒疫苗免疫所诱导的中和抗体均在一定程度上可以保护GEF不被GPV感染。