目的:制备一种新型的壳聚糖聚合物——水凝胶,并使其具备W下功能和特性:对细胞分裂增值有促进作用:可成为多种细胞、药物、生物活性物质的载体:能作为活性组织细胞生长的支架;促进骨组织再生愈合。方法:1)W天然壳聚糖、明胶为原料,先按多种配比与化学交联剂京尼平、离子交联剂甘油-2-確酸二纳进行双重交联,再把可在符合初始设计要求规定时间范围内成胶的壳聚糖水凝胶样品制备成多个不同配比的水凝胶細胞培养基,然后对所有培养基样品进行骨髓间充质干细胞接种,最后W相差显微镜观察水凝胶培养基中生长情况为标准,初步筛选出适合細胞生长的壳聚糖水凝胶制备方案。2)选用多种常用的骨生物工程材料检测方法对初筛制备出的水凝胶进行理化特性方面检测,往括对水凝胶进行表面电镜担描、振荡剪切流变学、体外释放动力学检测,测定刚度及表面结构。在生物学特性检测方面,对水凝胶細胞巢细胞培养进行巧光染色激光共聚焦担描、细胞活力增殖实验、细胞诱导迁移实验、实时P抓测定人骨髓间充质干细胞成骨基因的表达、免疫组化法测定ALP表达I W及新西兰大白兔化骨缺损修复模型实验,根据细胞生长状态及体内外成骨特性,进一步筛选出更好的水凝胶配比。结果:1)通过水凝胶理化特性检测和体内外成骨实验的歸选实验,歸选后的木凝胶制备流程和配比为:1.化%壳聚糖溶液、纯水、1.8%明胶溶液,按4:1:1比例混匀攪拌30Min后加热至35°C,再加入浓度为50mmol/8ul、体积比35:1的京尼平溶液化学交联20Min,再加入浓度0.8g%ml、体积比160:1的甘油-2-蹲酸二納离子交联剂混匀揽拌5Miri实现离子交联过程,放置37度温箱脖育120Min。2)水凝胶表面电镜担描显示,木凝胶表面呈多孔网状结构,孔表面欠光滑,化径随木凝胶中京尼平浓度的増加而逐渐增大。木分子含量高,利于液体交换,可提供适合细胞生长的微环境。3)流变学检测中发现,水凝胶刚性模量变化范围在0.1437±0,OlOOkPa和3.5787±0.3200kPa之间:巧弹性模量在0.0026±0.OOOSkPa和0.01加±0.0085 kPa之间。水凝胶原位成胶的时间在10-133Min之间。随着京尼平浓度的增加,水凝胶原位成胶速度加快,成胶明显缩短,刚性模量G,(Kpa)增加、枯弹性模量G"(Kpa)增加。配比4-l+NxOSx.lAx,8x)成胶时间、表面刚度更符合要求。4)激光共聚焦担描显微镜观察发现,所有配比为4-1+Nx系列的水凝胶培养基均能支持细胞正常增殖、分化。配比为4-1+12X的水凝胶,细胞分化、生长状态最好,细胞增殖速度最快。5)采用ELISA法检测到携载不同浓度rhBMP-2的木凝胶均有良好的体外释放动力学效果,所有浓度的水凝胶载体均能稳定持续地释放不同浓度的BMP-2,早期表现为爆发性释放,7天后呈持续稳定的缓慢释放,28天时仍达6.40%±0.55%。释放浓度、释放速度与載体BMP-2原始浓度呈正相关。6)接种于水凝胶培养基中的人骨髓间充质干细胞采用MTT法观察发现实验组第1-7天的增殖速度明显超过对照组,且增殖峰值提前。7)采用小室法观察法观察细胞迁移实验显示,所有携载活性诱导因子rhBMP-2的水凝胶培养基对人骨髓间充质干细胞都有诱导作用,但不同rhBMP-2浓度的水凝胶载体对同种细胞,诱导作用不同,实验组中rhBMP-2浓度500ng/ml的水凝胶载体,诱导作用最强。8)实时PCR检测培养于携带不同浓度BMP-2的水凝胶上的人骨髓间充质干细胞成骨基因mRNA的表达时发现,所有携载BMP-2的实控组与空白对照组相比,低浓度的BMP-2对人肯髓间充质干细胞成骨基因的表达即有显著的促进作用,随携载浓度增加促进作用加强。9)在新西兰大白兔槐贵骨缺损模型的体内动物实验中,术后4周、8周、12周成骨情况观察,X线照片、micro-CT担描王维重建成像及特殊成骨染色互个方面均显示:携带BMP-2及自体成骨细胞的水凝胶实验组与对照组相比有明显统计学差异、实验组在骨形成及修复方面有明显优势。结论:制备、筛选出了新型水凝胶,W生物王程材料评价方法对其理化特性、体、内外生物学特性进巧检测、评估,认为其制备方案及流程合理,达到初始设计目标及要求,能为活性组织细胞生长提供多功能支持的微环境,对细胞增殖分化有促进作用:并可作为多种细胞、药物、生物活性物质的载体,可作为骨细胞生长支架,促进骨组织再生,为解决临床中长段骨缺损、骨不连的治疗难题,提供一个新的思路和方法。