论文部分内容阅读
Dac基因克隆来源与果蝇，Dach1基因是脊椎动物dac基因的同源基因。人DACH1基因编码DACH1蛋白，该蛋白发挥转录因子的作用，在激素受体相关的肿瘤中发挥抑癌的作用。在本研究中我们利用Western-blotting方法以及实时荧光定量PCR的方法检测发现DACH1在肺腺癌及鳞癌组织中低表达，经统计学验证DACH1表达水平与临床分期相关，提示DACH1在肺腺癌及鳞癌发生发展的发挥重要作用。前期的miRNA芯片结果提示miRNA302d在肺腺鳞癌中异常表达而DACH1是其靶基因。本研究中我们利用RT-PCR技术检测肺腺癌鳞癌及其对应癌旁组织中miRNA302d的表达水平，结果发现miRNA302d在肺腺癌及鳞癌组织中高表达。根据组织中获得的检测结果，我们推测miRNA302d可能通过调控DACH1的表达影响肺腺癌及鳞癌的生物学行为。因此，在进一步的研究中，我们利用腺癌细胞株LTEP-α-2以及鳞癌细胞株SK-MES-1两株细胞进行相关细胞学实验以验证推测的合理性。研究结果发现，细胞周期实验、细胞增殖活性检测实验以及细胞平板成克隆能力实验均的结果提示miRNA302d可调控肺腺癌及鳞癌细胞的增殖能力。细胞Western-blotting实验、荧光素酶基因报告实验结果提示miRNA302d可直接调控DACH1的表达。RNAi干扰实验结果则提示miRNA302d是通过调控DACH1表达来影响肺腺癌及鳞癌生物学行为的。综合以上研究成果我们认为，DACH1及miRNA302d在肺腺癌及鳞癌的发生发展中发挥重要作用，miRNA302d可通过调控DACH1的表达促进肺腺癌及鳞癌的增殖能力。第一部分DACH1在肺腺癌鳞癌及对应正常组织中的表达目的：通过Western-blotting方法检测以及RT-PCR方法检测DACH1在肺腺鳞癌中的表达，以明确DACH1蛋白在肺腺鳞癌中的表达情况。方法：(1)1.利用蛋白裂解液等溶剂抽提肺癌组织中的蛋白；2.采用Bradford方法，并绘制标准曲线，以测定蛋白浓度；3.配制SDS-PAGE电泳液，并按实验相应条件进行SDS-PAGE电泳；4.利用PVDF膜，按转膜条件进行转膜；5.在不同条件下，分别加入一抗、二抗进行免疫反应；6.进行化学发光反应，根据不同的光强度调整曝光条件；7.凝胶图像分析。(2)抽提肺癌样本（癌组织及其相应癌旁组织）总RNA，反转成cDNA后，采用RT-PCR方法对DACH1的mRNA水平表达进行检测。(3)利用t检验方法检验DACH1表达水平与临床分期的相关性结果：(1)肿瘤标本内DACH1蛋白含量均低于对应癌旁(正常)组织内DACH1蛋白含量，统计学结果表明，肺癌标本内DACH1蛋白含量低于正常组织内DACH1蛋白含量具有统计学差异(P=0.024<0.05);(2)肿瘤标本内DACH1蛋白含量均低于对应癌旁(正常)组织内DACH1蛋白含量，统计学结果表明，肺癌标本内DACH1蛋白含量低于正常组织内DACH1蛋白含量具有统计学差异(P=0.0196<0.05);(3)经t检验分别检测DACH1表达水平与临床分期相关。结论：DACH1在肺腺癌及鳞癌组织中低表达且表达水平与临床分期密切相关，提示DACH1可能在肺腺癌及鳞癌的发生发展中发挥重要作用。第二部分miRNA302d在肺腺癌鳞癌及对应正常组织中的表达目的：利用RT-PCR方法检验临床组织标本中miRNA302d水平，以验证miRNA302d在肺腺鳞癌及其对应正常组织中的表达差异。方法：1.利用组织研磨机在液氮条件下充分磨碎组织；2.利用RNA抽提试剂盒，严格按照操作手册要求和方法抽提组织中RNA；3.根据实验要求配制RNA反转录反应液，利用PCR仪进行反转录获得c-DNA,稀释后4℃保存；4.根据实验要求配制RT-PCR反应液，利用RT-PCR仪进行miRNA302d扩增实验；5.利用step one software软件分析miRNA302d扩增结果，收集实验数据进行统计分析。结果：癌组织RQ值明显高于癌旁组织的RQ值，miRNA302d在肺腺鳞癌内高表达。结论：miRNA302d在肺腺鳞癌中表达水平显著高于对应的癌旁组织中miRNA302d的表达水平，这一结果提示miRNA302d高表达可能与肺腺鳞癌的发生发展密切相关。第三部分miRNA302d调控DACH1表达影响肺腺鳞癌生物学行为的机制研究目的：1.明确miRNA302d高表达对肺腺鳞癌的生物学行为的影响；2.明确miRNA302d是否通过直接调控DACH1的表达影响肺腺鳞癌的生物学行为。方法：1.利用lipo2000将miRNA302d-mimcs或miRNA302d-inhbitors转染腺癌细胞株LTEP-α-2以及鳞癌细胞株SK-MES-1两株细胞；2.利用流式细胞仪检测细胞周期变化；3.采用MTT实验方法观察细胞增殖活性变化；4.采用平板细胞成克隆实验方法，观察细胞成克隆能力变化；5.利用Western-blotting技术检测细胞DACH1蛋白的表达变化；6.构建荧光素酶报告基因载体，进行荧光素酶报告基因实验，验证miRNA302d与DACH基因的直接结合作用；7.利用RNAi技术直接阻断细胞内DACH1基因表达，观察细胞表现变化。结果：1. miRNA302d表达上调促进了肺腺鳞癌细胞的增殖能力的上升，miRNA302d在肺腺鳞癌中发挥促增殖的作用;2. miRNA302d可直接作用与DACH1基因的3’端UTR区，发挥抑制DACH1基因表达的功能；直接阻断DACH1表达可使肺腺鳞癌细胞增殖能力的上升，并且可逆转低表达miRNA302d对肺腺鳞癌细胞增殖能力的抑制作用。结论：miRNA302d具有促进肿瘤增殖的作用，其作用机制主要是通过直接抑制DACH1表达来实现。