研究背景：膀胱癌是我国泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈现不断增高的趋势。临床上70%左右的膀胱癌患者确诊时为非肌层浸润性膀胱癌(nonmuscle invasive bladder cancer, NMIBC),其主要治疗方法为经尿道膀胱肿瘤电切术(transurethral resection of bladder tumor, TUR-Bt),但术后复发率高是导致手术治疗失败的主要原因。研究表明,TUR-Bt术后5年肿瘤复发率高达600%-70%,且有25%左右的患者会进展为浸润性膀胱癌。目前预防NMIBC患者术后复发及进展的最有效办法是在TUR-Bt术后辅以膀胱灌注疫免抑制剂或化疗药物。尽管膀胱灌注在近期具有一定的疗效,但目前常用的灌注药物均存在不同程度的全身或局部毒副反应,包括骨髓抑制、过敏反应以及膀胱刺激征等。此外,仍有20%左右的患者虽经膀胱灌注但肿瘤仍会复发。患者一旦进展为转移性膀胱癌,治疗主要采用以顺铂为主的化疗方案,尽管大多数膀胱癌患者对含顺铂的化疗方案比较敏感,但是其疗效却并不能持久,患者5年生存率仅为20%-40%。鉴于目前膀胱癌灌注药物和化疗药物疗效的不稳定性及其显著的毒副作用,寻找安全而有效的膀胱癌治疗药物已经成为肿瘤治疗领域研究的热点和难点。二甲双胍是目前临床应用最为广泛的口服降糖药物,主要用于治疗2型糖尿病患者。近年来多项体外研究和动物实验发现二甲双胍对多种肿瘤细胞具有一定程度的抑制作用,并可显著增强化疗药物的抗肿瘤作用。而相关的临床研究同样表明,服用二甲双胍的糖尿病患者罹患恶性肿瘤的风险以及肿瘤相关死亡率明显小于采用其他降糖药物或胰岛素的糖尿病患者。在患有糖尿病的乳腺癌或肺癌患者中,接受化疗的同时服用二甲双胍可能与更好的预后密切相关,提示二甲双胍可能具有增强化疗方案临床疗效的作用。关于膀胱癌患者的临床研究同样表明,在合并患有糖尿病的膀胱癌患者中,服用二甲双胍降低血糖的患者其肿瘤复发风险明显低于未服用二甲双胍的患者,提示二甲双胍对膀胱癌患者同样具有一定程度的保护作用。尽管已有体外细胞实验、动物实验以及临床证据的支持,二甲双胍抑制肿瘤的作用机制至今仍不清楚,而其对膀胱肿瘤细胞的直接抑制作用,仍需要在体外细胞模型和动物模型中进行验证。另一方面,卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)作为目前治疗中危和高危NMIBC患者首选的灌注药物,可显著降低患者疾病复发和进展的风险,研究表明其抑制膀胱肿瘤的作用可能是以肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体[tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL]作为效应分子实现的,而TRAIL因其本身能够选择性地诱导肿瘤细胞发生凋亡而对大多数正常细胞无毒副作用,已被研究用以治疗膀胱肿瘤。结合二甲双胍可能增强化疗药物临床疗效的实验数据和临床证据,我们认为二甲双胍可能能够增强TRAIL对膀胱癌细胞的抑制作用,而二甲双胍联合TRAIL极有可能成为膀胱肿瘤的有效治疗方案,这同样需要体外实验的验证。本课题的第一部分和第二部分,我们分别在体外细胞模型和裸鼠皮下移植瘤模型中,对二甲双胍对膀胱癌细胞的抑制作用进行了验证；本课题的第三部分,我们通过体外细胞实验对二甲双胍联合TRAIL用以治疗膀胱癌的可能性进行了初步探讨。研究内容：1.以膀胱癌细胞及裸鼠皮下移植瘤模型为研究对象,通过体外实验和体内实验检测二甲双胍对膀胱癌细胞增殖的抑制作用,并探讨二甲双胍引起上述抑制作用的相关分子机制。2.以膀胱癌细胞为研究对象,通过体外实验检测二甲双胍是否可以增加膀胱癌细胞对TRAIL的敏感性,并探讨二甲双胍引起上述增敏作用的相关分子机制。研究方法：1.采用MTT法检测不同浓度的二甲双胍对膀胱癌细胞的增殖活性以及生长曲线的影响；采用平板克隆形成实验检测不同浓度的二甲双胍对膀胱癌细胞体外克隆形成能力的影响；2.采用Annexin V-FITC/PI染色方法检测二甲双胍干预后膀胱癌细胞发生凋亡的情况；采用Western blot法检测二甲双胍是否能够诱导膀胱癌细胞PARP断裂活化；采用流式细胞术检测二甲双胍对膀胱癌细胞周期的影响；采用Western blot法检测二甲双胍对细胞周期G0/G1期关键调节蛋白cyclin D1、CDK4、E2F1和P21的影响；3.采用Western blot法检测二甲双胍对膀胱癌细胞中AMPK (Thr172)、mTOR (Ser2448)、S6K1(Thr389).4E-BP1(Thr37/46)磷酸化水平的影响；4.构建膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型,检测腹腔注射二甲双胍对膀胱癌皮下移植瘤生长的影响,同时观察二甲双胍对裸鼠体重、瘤重及饮食量的影响；采用免疫组织化学染色及Western blot法检测二甲双胍对膀胱癌皮下移植瘤细胞内PCNA、 cyclin D1、p-mTOR (Ser2448)蛋白表达的影响；5.采用Annexin V-FITC/PI染色方法检测二甲双胍对TRAIL诱导膀胱癌细胞凋亡的影响；采用Western blot法检测二甲双胍对TRAIL诱导的caspases激活的影响；采用Western blot法检测二甲双胍对TRAIL凋亡通路重要成员DR4、DR5、 c-FLIPL的影响；采用qRT-PCR检测二甲双胍干预对c-FLIPL转录水平的影响；引入蛋白酶体抑制剂MG132和放线菌酮,分别检测二甲双胍干预对c-FLIPL蛋白的降解及其稳定性的影响；采用siRNA敲除膀胱癌细胞S6K1验证二甲双胍下调c-FLIPL表达的机制。研究结果：1.二甲双胍显著抑制膀胱癌细胞的体外增殖能力和克隆形成能力MTT结果显示二甲双胍可显著抑制膀胱癌细胞5637和T24的体外增殖能力,且呈明显的浓度依赖性和时间依赖性；平板克隆形成实验显示二甲双胍可显著抑制膀胱癌细胞5637和T24的克隆形成能力,且呈明显的浓度依赖性。2.二甲双胍不能诱导膀胱癌细胞发生凋亡而诱导其细胞周期阻滞在G0/G1期Annexin V-FITC/PI染色显示二甲双胍并未增加膀胱癌细胞Annexin V阳性细胞的比例,Western blot结果显示二甲双胍并未激活膀胱癌中PARP的断裂活化,提示二甲双胍不能诱导膀胱癌细胞发生凋亡；流式细胞术检测发现二甲双胍可显著增加处于G0/G1期的膀胱癌细胞所占的比例,Western blot结果显示二甲双胍显著下调膀胱癌细胞中cyclin D1、CDK4、E2F1的表达,并可上调P21的表达水平,提示二甲双胍可诱导膀胱癌细胞周期阻滞在G0/G1期。3.二甲双胍激活膀胱癌细胞AMPK/mTOR信号通路Western blot显示检测二甲双胍显著增加膀胱癌细胞中AMPK在Thr172位点的磷酸化水平,提示二甲双胍能够激活膀胱癌细胞AMPK信号通路；二甲双胍显著降低膀胱癌细胞中mTOR在Ser2448位点、S6K1在Thr389位点以及4E-BP1在Thr37/46位点的磷酸化水平,说明二甲双胍能够显著抑制膀胱癌细胞mTOR信号通路。4.二甲双胍抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生长将膀胱癌细胞5637接种于裸鼠左侧后腿背侧皮下,成功构建膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型；腹腔注射二甲双胍(100mg/kg/day)可显著抑制膀胱癌皮下移植瘤的生长并减轻瘤重,而对裸鼠的体重、饮食及一般情况并未产生影响；免疫组织化学染色以及Western blot均证实二甲双胍可下调膀胱癌皮下移植瘤细胞内PCNA, cyclinD1和p-mTOR (Ser2448)的表达。5.二甲双胍增强TRAIL对敏感膀胱癌细胞的凋亡诱导作用Annexin V-FITC/PI染色和Western blot结果表明,二甲双胍可显著增强TRAIL在敏感膀胱癌细胞(5637、253J和RT4)所诱导的Annexin V阳性细胞比例和caspases的活化程度,提示二甲双胍可增强TRAIL对敏感膀胱癌细胞的凋亡诱导作用；而在TRAIL抵抗性膀胱癌细胞T24中,二甲双胍并不能逆转其对TRAIL的抵抗。6.二甲双胍通过下调c-FLIPL的表达增加膀胱癌细胞对TRAIL的敏感性通过对TRAIL/死亡受体介导的凋亡通路中重要成员的检测,二甲双胍干预并未上调DR4和DR5的表达水平,而是显著地下调c-FLIPL的表达以增加膀胱癌细胞对TRAIL的敏感性。7.二甲双胍过抑制mTOR/S6K1通路下调膀胱癌细胞c-FLIPL的表达二甲双胍干预并未影响c-FLIPL的转录、降解和蛋白稳定性；Western blot结果表明二甲双胍干预可显著下调p-mTOR (Ser2448)和P-S6K1(Thr389)的水平,提示二甲双胍可抑制膀胱癌细胞mTOR/S6K1通路；采用特异性siRNA敲除膀胱癌细胞S6K1后可显著下调c-FLIPL的表达水平。结论：1.二甲双胍显著抑制膀胱癌细胞的体外增殖和裸鼠皮下移植瘤的生长；2.二甲双胍通过诱导膀胱癌细胞周期GO/G1期阻滞、激活AMPK/mTOR信号通路,发挥其对膀胱癌细胞的体外和体内抑制作用；3.二甲双胍通过抑制mTOR/S6K1信号通路下调c-FLIPL的表达,增加膀胱癌细胞对TRAIL的敏感性；4.二甲双胍单独或与TRAIL联合用药可能是极具发展前景且相对安全的膀胱肿瘤治疗方案。