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目的聚肌胞苷酸（polycytidylic acid,Poly（I:C））是美国国家癌症研究所认可的有治疗潜力的癌症疫苗佐剂。可激活多种固有免疫细胞促进抗原提呈活化CD8+T细胞向肿瘤浸润。但Poly（I:C）对进展期肿瘤没有疗效,与其激活巨噬细胞核因子k B（nuclear factor-kappa B,NF-κB）,诱导主要由M2巨噬细胞分泌的Treg趋化因子CCL22致Treg肿瘤浸润,进而免疫抑制CD8+T细胞有关。乌头碱（aconitine,AC）可抑制巨噬细胞NF-κB转录活性,并下调NF-κB下游分子环氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX2）/前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）在单核细胞中的表达及外周血Treg比例。猜测AC可减弱NF-κB信号,抑制Poly（I:C）诱导的CCL22产生及Treg肿瘤浸润,以维持CD8+T细胞肿瘤浸润及免疫应答。前期研究显示两者联合治疗Hepa1-6移植瘤小鼠,抑瘤率达33.53～56.69%,本研究拟验证以上猜测并探讨其机制。方法1.CD4+、CD8+T细胞,Treg肿瘤浸润:构建Hepa1-6细胞移植瘤C57BL/6小鼠模型,每隔1天称重并给药,第22天处死剥取肿瘤计算抑瘤率。制备脾脏、引流淋巴结、肿瘤细胞悬液,流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞,Treg（CD4+Foxp3+）占比,及T细胞活化指标CD69、IFN-γ,免疫检查点分子CTLA4;免疫组化检测肿瘤组织CD8表达。2.CD4+、CD8+T细胞,Treg迁移:取小鼠骨髓培养原代巨噬细胞M2极化模型,应用Transwell板检测药物干预后M2巨噬细胞上清对小鼠脾脏淋巴细胞的趋化效果,收集迁移细胞,流式细胞仪检测CD4+、CD8+T细胞,Treg占比。3.趋化因子表达:药物干预M2巨噬细胞或肿瘤外植体后,取细胞或组织提取m RNA,实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantification,RT-q PCR）检测Treg趋化因子CCL22 m RNA,CD8+T细胞趋化因子CXCL10、CCL5 m RNA表达。取上清酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测CCL22分泌。4.CCL22表达相关信号:药物干预后,Western Blot及免疫荧光检测原代M2巨噬细胞NF-κB p65蛋白活化水平及核移位,并检测TNF-α、COX2、CCL22m RNA动态表达及CCL22分泌。Poly（I:C）联合NF-κB或TNF-α抑制剂干预,检测肿瘤外植体、M2巨噬细胞TNF-α、COX2、CCL22 m RNA及CCL22分泌。结果1.Poly（I:C）及联合药物增加CD8+T细胞肿瘤浸润、迁移及CXCL10、CCL5m RNA表达。（1）Poly（I:C）及联合药物促进CD8+T细胞肿瘤浸润、迁移:相比未治疗组,流式结果显示AC、Poly（I:C）、联合组肿瘤组织中CD4+T细胞比例无差异（P＞0.05）,CD8+T细胞比例均升高（P＜0.001,P＜0.05,P＜0.01）免疫组化结果也显示CD8表达上调（P＜0.05,P＜0.001,P＜0.0001）,且联合组高于AC、Poly（I:C）组（P＜0.001,P＜0.0001）。细胞迁移实验显示,AC组CD4+T细胞迁移比未治疗组降低（P＜0.05）,Poly（I:C）和联合组无差异（P＞0.05）;AC组CD8+T细胞迁移无差异（P＞0.05）,Poly（I:C）和联合组CD8+T细胞迁移增多（P＜0.01）。（2）Poly（I:C）及联合药物上调M2巨噬细胞CXCL10、CCL5 m RNA表达:相比未干预组,AC组CXCL10、CCL5 m RNA表达无差异（P＞0.05）,Poly（I:C）与联合组均上调（P＜0.01,P＜0.001）。提示Poly（I:C）趋化CD8+T细胞可能依赖于M2巨噬细胞产生的CXCL10、CCL5。2.Poly（I:C）增加Treg迁移及CCL22 m RNA表达、分泌,AC可降低该效应。（1）AC抑制Poly（I:C）诱导的脾脏Treg占比及M2巨噬细胞介导的迁移:相比未治疗组,Poly（I:C）治疗小鼠脾脏Treg比例升高（P＜0.05）,AC、联合组Treg无差异（P＞0.05）,且均低于Poly（I:C）组（P＜0.01）。迁移实验显示,相比未干预组,AC组迁移的Treg占比无差异（P＞0.05）,Poly（I:C）、联合组均增多（P＜0.01）,其中联合组低于Poly（I:C）组（P＜0.05）。（2）AC抑制Poly（I:C）诱导的M2巨噬细胞及肿瘤外植体CCL22 m RNA表达、分泌:M2巨噬细胞研究发现,相对未干预组,Poly（I:C）上调3、6、12 h CCL22 m RNA（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.001）及24 h蛋白分泌（P＜0.01）,AC组3、6、12 h表达及蛋白分泌均无差异（P＞0.05）,24 h m RNA下调（P＜0.05）,联合组虽6、12 h表达上调（P＜0.01,P＜0.05）,但分泌无差异（P＞0.05）;尤其相比Poly（I:C）,联合组3 h CCL22 m RNA表达及分泌降低（P＜0.01,P＜0.05）。肿瘤外植体研究有相似的发现,相对未干预组,Poly（I:C）干预后24 h上调CCL22 m RNA及蛋白分泌（P＜0.001,P＜0.01）,AC、联合组虽然上调m RNA表达（P＜0.05,P＜0.01）,但蛋白分泌无差异（P＞0.05）;尤其相比Poly（I:C）,联合组表达及分泌均降低（P＜0.01）。3.联合药物升高迁移的CD8+T细胞与Treg比值及CD8+T细胞活化。分析CD8+T细胞与Treg迁移比发现,联合组高于Poly（I:C）组（P＜0.01）与未干预组（P＜0.05）,与AC组无差异（P＞0.05）,Poly（I:C）低于未干预组（P＜0.05）。比未治疗组,联合组小鼠脾脏CD4+、CD8+T细胞比例增多（P＜0.01,P＜0.05）,AC及联合组CD4+T细胞免疫检查点分子CTLA4的表达降低（P＜0.05）;引流淋巴结CD4+、CD8+T细胞比例减少（P＜0.01）,但CD4+CD69+、CD8+CD69+T细胞占比升高（P＜0.01）;联合组肿瘤组织中产生IFN-γ的CD8+T细胞占比升高（P＜0.01）。4.AC抑制Poly（I:C）诱导的CCL22表达分泌与NF-κB/COX2信号有关。相比未干预组,AC组M2巨噬细胞NF-κB p-p65蛋白表达、核移位及CCL22分泌无差异（P＞0.05）,干预后仅6 h TNF-α、COX2显示轻度的表达差异（P＜0.05）;Poly（I:C）、联合组NF-κB p-p65蛋白表达、核移位及CCL22分泌升高（P＜0.05）,3、6、12 h TNF-α（P＜0.001）、3、6、12、24 h COX2（P＜0.01）表达明显上调,分别于3、6 h达到高峰,且高于AC组（P＜0.001,P＜0.0001）;尤其相比Poly（I:C）,联合药物降低NF-κB p-p65蛋白表达、核移位及CCL22分泌（P＜0.05）,下调TNF-α、COX2在高峰时间点的表达（P＜0.01,P＜0.001）。Poly（I:C）分别联合NF-κB或TNF-α抑制剂与联合AC有相同的效应。相比Poly（I:C）,三个联合组肿瘤外植体TNF-αm RNA表达无差异（P＞0.05）,COX2、CCL22表达均下调（P＜0.01）;尤其是CCL22蛋白分泌在M2巨噬细胞（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.0001）或肿瘤外植体（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）均降低。结论1.Poly（I:C）促进CD8+T细胞肿瘤浸润、迁移;2.AC抑制Poly（I:C）诱导的CCL22表达分泌、Treg迁移,其机制与抑制M2巨噬细胞NF-κB/COX2信号有关;3.AC联合Poly（I:C）升高CD8+T细胞与Treg迁移比、活化CD8+T细胞而抑瘤。