论文部分内容阅读
脓毒症(Sepsis)指动物或植物因为细菌的存在而发生的腐败,是创伤、烧伤、休克、感染、大手术等临床急危重患者的严重并发症之一,也是诱发脓毒性休克(Septic Shock)、多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)的重要原因。虽然近几年临床上进行了大量的研究,仍缺乏有效的治疗方法,依然以非特异性支持治疗为主。脓毒症患者常常出现严重的进行性体腔及组织水肿,而随着水肿的发展,增加了氧输送及氧弥散的距离,导致组织缺氧,加重器官功能的损害。导致水肿的原因,是由于在脓毒症或系统性炎症反应综合症的发生发展过程中,血液中脂多糖、凝血酶及某些致炎细胞因子浓度增高,导致血管内皮通透性增高,血浆蛋白大量外渗,从而造成组织水肿。
内皮细胞广泛存在于血管壁内面,具有半透膜样屏障功能,参与控制血液与组织间液体、电解质及蛋白的交换。内皮细胞的骨架蛋白和连接蛋白是构成内皮细胞半透膜屏障的主要物质基础,内皮细胞的细胞骨架特别是肌动蛋白(F-actin)的重组和再分布是导致内皮细胞收缩和通透性增高的病理基础。血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)是内皮细胞特异性的黏附蛋白,是调节细胞间隙形成、内皮黏附连接的主要组成部分,起连接跨膜蛋白与肌动蛋白细胞骨架的作用,其结构和功能的改变可引起细胞连接破坏、细胞骨架结构改变,从而导致细胞间缝隙形成、血管通透性升高。近年研究证实,肝素除了具有公认的抗凝血、抗血栓作用,还具有抗炎、免疫调节、抑制细胞增殖、抗肿瘤转移等多种生物学活性和药理作用。它还可以通过抑制白细胞黏附活化,抑制补体的激活,保护血管内皮细胞免受趋化因子、组胺、细菌内毒素及氧自由基等损伤,以及维持内皮细胞完整性等。我科前期研究已经证实肝素可以对LPS诱导的内皮细胞通透性增高起到保护作用,并能够稳定细胞骨架,减少应力纤维的形成,而且肝素可以改善LPS诱导的内皮细胞紧密连接的减少,引起Ecs间ZO-1表达增多,密闭环断开减少;本研究试图探讨肝素在保护内皮细胞黏附连接方面的作用。
材料与方法
一、细胞培养
人脐静脉内皮细胞购于南京凯基生物技术公司。生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。置于37℃,5%CO2细胞培养箱中,每隔1-2日换液。
二、分组
人脐静脉内皮细胞株传代培养后随机分4组(n=5),施以相应处理:①对照组(加入等量PBS);②内毒素组(LPS10μg/ml);③肝素组(UFH10U/ml);④内毒素及肝素组(UFH10U/ml+LPS10μg/ml)。
三、实验方法
用MTT法测定内皮细胞活性;用transwell小室法测定单层内皮细胞通透性;用免疫荧光染色法测定内皮细胞血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)形态;用免疫荧光染色法测定P120-连环蛋白(P120-catenin)的表达。
四、统计学分析
所有实验均重复3次以上,计量数据以均数±标准差表示,应用SPSS17.0统计软件包进行分析。两组间均数比较采用两样本均数t检验,多组间均数比较采用多个样本均数方差分析。P<0.05认为有统计学意义。
实验结果
与空白对照组比较,LPS10mg/L及100mg/L对细胞活性起到明显的抑制作用(0.526±0.027、0.249±0.044比0.655±0.007,P≤0.05和P≤0.01),肝素100U/ml对内皮细胞活性产生抑制作用(0.561±0.023比0.655±0.007,P≤0.05); LPS10mg/L可增加单层内皮细胞通透性,于6h时达峰值,与空白组比较差异有统计学意义(P≤0.05);LPS能使黏附连接中血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)及P120-catenin的表达减少;而应用肝素10U/ml预处理后,在2~12h时单层内皮细胞的通透性较LPS组降低(P≤0.05),并能增加VE-cadherin及P120-catenin的表达。结论:LPS刺激下单层内皮细胞通透性增加、内皮细胞VE-cadherin的表达减少、内皮细胞P120-catenin的表达减少;肝素对LPS刺激下内皮细胞VE-cadherin及P120表达减少有保护作用;肝素对LPS诱导内皮细胞通透性有保护作用。
结论:
肝素降低LPS刺激下单层内皮细胞通透性;肝素增加LPS刺激下内皮细胞VE-cadherin的表达;肝素增加LPS刺激下内皮细胞P120-catenin的表达;肝素对LPS诱导内皮细胞通透性有保护作用。