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肌肉是动物机体利用葡萄糖最重要的组织,其糖代谢是维持机体内环境稳定的重要基础,大量的研究集中在胰岛素刺激葡萄糖转运的信号转导通路上。胰岛素和运动均促使葡萄糖转运子4转位到细胞膜上,转运更多的葡萄糖进入细胞而调节细胞的葡萄糖摄取量。普遍认为,胰岛素和运动引发的葡萄糖转运机制是完全不同的,胰岛素激发的葡萄糖转运主要依赖于P13K的激活,而运动导致的糖摄取则可能有Ca2+和AMPK的参与。相对于胰岛素,对运动/肌肉收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖的机制了解较少。目前研究运动/肌肉收缩多应用转基因动物,但成本高,操作复杂。而应用培养的细胞株则没有诸多限制,费用较低,并可单独分析细胞内信号转导。本研究的目的是应用稳定过表达GLUT4myc的能收缩的C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌细胞模型探讨运动/肌肉收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4运输机制中AMPK和CaMKⅡ的作用。方法：第一部分确定C2C12GLUT4myc细胞的培养和分化条件。测定此细胞的GLUT4myc转位响应Carbachol刺激的时间曲线,并用Western blot法检测Carbachol对AS160的调节作用。第二部分测定在Carbacho1刺激下骨骼肌细胞内Ca2+浓度的变化。第三部分在AMPK和CaMKⅡ的特异性药物抑制剂存在的条件下,测定收缩刺激GLUT4myc转位,并用Western blot法检测高钾溶液和Carbachol对ACC、 AMPK、CaMKⅡ和CaMKⅠ的调节作用,研究AMPK和CaMKⅡ在收缩刺激GLUT4myc转位中的作用。结果：第一部分比较不同浓度Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc转位,结果显示,C2C12GLUT4myc细胞的GLUT4myc转位对Carbachol的作用呈剂量和时间依赖关系。0.1mM和1mM的Carbachol刺激均增加细胞表面GLUT4myc含量,0min为基础状态,0.1mM Carbachol刺激20min使GLUT4myc转位达最大值,为基础状态的(1.91±0.41)倍(p<0.05)；1mM Carbachol刺激10min使GLUT4myc转位达最大值,为基础状态的(2.00±0.14)倍(p<0.05)。第二部分用激光共聚焦显微镜测定在Carbachol和Caffeine刺激下骨骼肌细胞内Ca2+浓度的变化。结果发现1mM Carbachol刺激使胞浆内Ca2+浓度急性上升,然后缓慢下降并长时间维持在一个较高的浓度：0.1mM Carbachol使细胞内Ca2+浓度呈上下波动趋势；1μM Carbachol使细胞内Ca2+急性上升并快速下降,然后维持在基础水平。3mM Caffeine使细胞内Ca2+浓度急性上升,并下降到一定水平后维持；5mM Caffeine使细胞内Ca2+到一较高水平,然后下降,.并呈上下波动趋势。第三部分在AMPK和CaMKⅡ的特异性药物抑制剂存在的条件下,测定收缩刺激GLUT4myc转位,并用Western blot法检测高钾溶液和Carbachol对ACC、 AMPK、CaMKⅡ和CaMKⅠ的调节作用,研究AMPK和CaMKⅡ在收缩刺激GLUT4myc转位中的作用。发现：1mM Carbachol刺激20min可增加C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc转位,10μM的CaMKⅡ抑制剂KN93预孵育30min,可抑制69%的Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p<0.05)。CaMKK抑制剂STO-609预孵育不影响Carbachol刺激的GLUT4myc转位。50μM骨骼肌肌球蛋白ATPase抑制剂(BTS)预孵育30min,可抑制37%的Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p<0.05)。与文献报道的一致,AMPK的抑制剂Compound C(CC)抑制了71%的Carbachol刺激的GLUT4myc转位(p<0.05)。Western blot检测细胞裂解液ACCpS79、AMPKpT172、CaMK II pT289、CaMK IpT177。研究结果表明,高钾溶液、Carbachol和Caffeine刺激均能增加C2C12GLUT4myc肌管CaMKⅡ的磷酸化水平；高钾溶液和Carbachol均可显著刺激AMPK的磷酸化,但不影响CaMKK的下游分子CaMKⅠ的磷酸化。AICAR和Carbachol使C2C12GLUT4myc肌管ACC活性增强,AMPK的抑制剂Compound C预先孵育细胞抑制此作用；AICAR和Carbachol均使AMPK活性增强,但Compound C不抑制此作用。BTS抑制Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管AMPK活性增强,不抑制AICAR刺激的C2C12GLUT4myc肌管AMPK活性增强。结论：1.可收缩的C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞的GLUT4myc转位对不同浓度Carbachol作用呈剂量和时间依赖关系；细胞响应Carbachol刺激的收缩作用,GLUT4myc转位到细胞膜。2. Carbachol和Caffeine刺激均能增加胞内Ca2+水平,最高分别可达基础状态的3.5倍和2.5倍。3.高钾和Carbachol去极化诱发的收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4myc转位,其信号转导机制不同于胰岛素,参与的信号分子可能涉及AMPK。表明肌肉收缩可替代胰岛素促进骨骼肌摄取葡萄糖。Ca2+敏感的与收缩有关的信号机制不需要CaMKK,可能需要CaMKⅡ。本课题应用研究肌肉收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖机制的C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞模型,测定了GLUT4转位对高钾和Carbachol刺激的收缩的响应,探讨了CaMKⅡ和AMPK等信号分子在收缩刺激GLUT4myc转位的信号转导中的作用机制,可为药物研发提供作用靶点,有助于临床干预、改善胰岛素抵抗。