研究背景和目的:钙结合蛋白S100超家族拥有超过24个成员,与大部分成员一样,S100A6编码基因定位于染色体1q21,该区域稳定性较差,易发生染色体重排和基因扩增。自从由Ehrlich腹水瘤中检出,对S100A6的研究已超过20年,目前认为该蛋白是一种活跃的信号蛋白分子,参与多种信号途径,调节细胞生理活动,并与肿瘤进程密切相关。目前的研究提示,S100A6在人黑色素瘤、直结肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、多数骨肉瘤和肝内导管上皮癌等肿瘤中高表达,并与其转移活动及病程相关。在分子水平上,S100A6能通过与Sgt1和melusin相互作用介导对热休克反应的调节;与P53相互作用,实现对细胞增殖与凋亡的调节;通过与RAGE (receptor for advanced glycation end products)结合、激活JNK和caspases途径诱导凋1亡;与annexin家族成员结合,调节细胞骨架与细胞迁移;与CacyBP/SIP相互作用调节β-catenin水平,而后者的胞内积聚被认为是肿瘤发展和转移的重要事件。我们的前期研究发现外源性rhS100A6能抑制多种肿瘤细胞系的增殖、迁移,并上调胞内β-catenin水平;但是,它对正常细胞是否具有相同作用尚无报道。因此,本课题拟以五株转化细胞系和两株肿瘤细胞系为实验对象,探讨外源性rhS100A6对其增殖、迁移和β-catenin水平的影响。尽管S100A6被发现在一些肿瘤组织高表达,但是,关于其表达随肿瘤发生发展进程的变化尚未见报道。这对阐明其在肿瘤发生发展中的作用具有重要意义。本研究拟建立兔肝VX2移植瘤模型,检测在荷瘤过程中S100A6在血清中的含量及在转移瘤组织中表达的动态变化,为进一步明确S100A6在肿瘤发生发展中的作用积累实验依据。方法:1.重组人S100A6蛋白( rhS100A6 )的制备:将pGST-Moluc-hS100A6转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导rhS100A6表达,谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)分离纯化、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis ,SDS-PAGE)和Western-blotting鉴定,BCA法定量,分装后-80℃保存备用。2.细胞增殖及迁移的检测:分别以终浓度均为3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml、1000μg/ml的rhS100A6作用于人胚肾细胞HEK293、人气道上皮细胞9HTE、小鼠胚胎成纤维细胞MEF、中国仓鼠卵巢细胞CHO、小鼠间充质干细胞C3H10T1/2、兔鳞状细胞癌细胞VX2和人骨肉瘤细胞143B。MTT法检测其增殖。根据该实验结果,筛选出30μg/ml作为后续实验的终浓度。在30μg/ml的rhS100A6作用上述细胞后,用MTT法连续测定5天内细胞增殖的变化,用细胞划痕实验和Transwell小室检测细胞迁移能力的变化。3.细胞内β-catenin水平的检测:30μg/ml的rhS100A6处理5种转化细胞系,分别使用免疫细胞化学法和Western-blotting法检测细胞内β-catenin表达水平。4.兔肝VX2移植瘤模型的建立:取自种兔的VX2鳞癌组织去包膜后,切成1mm×1mm×1mm小块,接种至肿瘤兔左肝下叶。术后密切观测肿瘤兔一般情况及肿瘤生长情况。5.标本采集:分别于接种后第7、12、17、19、21、23、25、27及29天处死动物,采集血清,分装后-80℃保存备用;采集肝内、网膜、肺上的转移瘤组织行石蜡切片。6.血清及转移瘤组织中S100A6含量的检测:用包被S100A6抗体的酶标板行ELISA检测血清中S100A6的含量;石蜡包埋组织切片后,用S100A6单克隆抗体行免疫组织化学检测S100A6在转移瘤中的表达。结果:1.重组蛋白rhS100A6制备成功。纯化后的诱导表达产物经过SDS-PAGE后,考马斯亮蓝染色,可见36KD处的GST-S100A6条带,经Quanity one分析纯度达92%;以S100A6抗体(1:1000),通过SDS-PAGE/Western-blotting法检测纯化后的GST-S100A6,出现阳性杂交条带。即rhS100A6制备成功。以标准化的BSA为参照品,以BCA法测定其浓度并绘制蛋白浓度标准曲线,由此曲线推算洗脱的rhS100A6(GST-S100A6)浓度为12.3 mg/ml,则1L菌液中可得6.15mg的rhS100A6。2.外源性rhS100A6对这5株转化细胞系(HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2)的增殖无明显影响,但是对2株肿瘤细胞系(143B和VX2)的增殖具有抑制作用,并呈一定的浓度、时间依赖性。1)浓度依赖性:5株转化细胞系在各浓度(3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml、1000μg/ml)的rhS100A6处理后,其OD值与实验对照组(GST组)相比,差异不具统计学意义(P>0.05);3μg/ml和10μg/ml的rhS100A6对2株肿瘤细胞系的增殖无明显影响;而随后的4个浓度的rhS100A6处理致VX2细胞的OD值分别较GST组下降19.3%、26.4%、37.8%和47.1%(P<0.05),143B细胞的OD值分别较GST组下降17.4%、23.8%、33.7%和35.2%(P<0.05)。2)时间依赖性:根据上述结果,选用30μg/ml浓度作时间依赖实验。在5天观察时间内,5株转化细胞系的rhS100A6组的OD值与GST组相比,差异不具统计学意义(P>0.05);而2株肿瘤细胞系的OD值从干预后第3天起开始降低,与GST组相比,VX2细胞第3-5天的OD值分别下降13.1%、16.3%和17.9%(P<0.05),143B细胞第3-5天的OD值分别下降11.7%、14.7%和16.6%(P<0.05)。提示:外源性rhS100A6对这5株转化细胞系(HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2)的增殖无明显影响,但是对2株肿瘤细胞系(143B和VX2)的增殖具有抑制作用,并呈浓度、时间依赖。3.外源性rhS100A6对这5株转化细胞系的迁移无明显影响,但是对2株肿瘤细胞系的迁移具有抑制作用。1)5株转化细胞系:(1)细胞划痕实验:30μg/ml的rhS100A6作用于5种转化细胞系,各个观测点的细胞迁移率与GST组的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)Transwell实验也进一步验证了上述结果:30μg/ml的S100A6作用于这5种细胞后,实验组穿膜细胞数与GST组的差异无统计学意义(P>0.05);同时,用33%醋酸溶液洗脱被甲基紫染色后的细胞,在490nm处读取其OD值(该值与穿膜细胞数成正比),该结果也进一步证实实验组与GST组差异无统计学意义(P>0.05)。提示,外源性rhS100A6对这5种转化细胞系(HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2)的迁移无明显影响。2) 2株肿瘤细胞系:(1)细胞划痕实验:30μg/ml的rhS100A6作用于VX2和143B,24小时后的细胞迁移率较GST组分别降低17.2%(P<0.05)和16.4%(P<0.05),差异具有统计学意义。(2)Transwell实验证实,30μg/ml的rhS100A6作用于VX2和143B后,其穿膜细胞数较GST组分别减少10.1%(P<0.05)和11.2%(P<0.05)。同时,用33%醋酸洗脱被甲基紫染色的细胞,VX2细胞实验组490nm处的OD值较GST组降低12.3%(P<0.05)。提示,外源性rhS100A6对VX2和143B细胞的迁移有抑制作用。综上:外源性rhS100A6对这5株转化细胞系(HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2)的迁移无明显影响,但是对2株肿瘤细胞系(VX2和143B)的迁移具有抑制作用。4.外源性rhS100A6上调5株转化细胞系的β-catenin水平。免疫细胞化学显示:实验组β-catenin阳性染色的平均光密度值均高于GST组,HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2分别增高25.4%、15%、22.1%、22.7%和28%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Western-blotting法检测结果也与上述结果一致:实验组阳性条带与内参条带的灰度比值较GST组均有升高,HEK293、9HTE、MEF、CHO和C3H10T1/2分别增高11.4%、21.9%、13%、14.8%和10.1%,差异具均有统计学意义(P<0.05)。提示:外源性rhS100A6能够上调这5株细胞的β-catenin水平。5.兔肝VX2移植瘤模型建立成功。实验共接种45只兔,成功建立兔肝VX2移植瘤模型45只,接种成功率100%。接种后肿瘤生长迅速,肿瘤兔存活期不超过30天;第15天前的兔体内未见明显转移灶,第17天时可见肝内转移及网膜转移,第25天可见肺转移,并开始表现恶病质。肿瘤组织病理切片证实为鳞状细胞癌。6.肿瘤兔血清S100A6含量随荷瘤进程呈进行性降低。从荷瘤第7天起到第29天,兔血清中S100A6的含量分别较对照组减少12.1% (P=0.237)、20.0%(P=0.105)、37.6%(P=0.01)、79.9%(P=0.01)、89.9%(P=0.01)、92.9%(P=0.01)、98.3%(P=0.01)、98.5%(P=0.01)和99.0%(P=0.01),即从第17天起(即发现肝内转移和网膜转移的时间),血清含量的差异有显著性。提示:肿瘤兔血清S100A6含量随荷瘤进程呈进行性降低。7. S100A6在肝内、网膜和肺的转移肿瘤组织中的表达随荷瘤进程进行性降低。免疫组织化学显示:在肝内、网膜和肺转移肿瘤组织中的S100A6阳性染色程度呈进行性降低,回归分析提示差异具有显著性(肝内肿瘤P=0.01,网膜肿瘤P=0.01,肺内肿瘤P=0.04)。提示:S100A6在肝内、网膜和肺的转移肿瘤组织中的表达随荷瘤进程呈进行性降低。结论:1.通过转化重组质粒到大肠杆菌,IPTG诱导表达和分离纯化,获得高纯度的rhS100A6蛋白。2.外源性rhS100A6对5株转化细胞系(人胚肾细胞HEK293、人气道上皮细胞9HTE、中国仓鼠卵巢细胞CHO、小鼠胚胎成纤维细胞MEF和小鼠间充质干细胞C3H10T1/2)的增殖及迁移无明显影响。3.外源性rhS100A6对兔鳞状细胞癌细胞VX2和人骨肉瘤细胞143B的增殖及迁移具有一定的抑制作用,并呈浓度、时间依赖。4.外源性rhS100A6能上调上述5株转化细胞系内β-catenin水平。5.随兔肝VX2移植瘤模型的进程,其血清S100A6水平进行性降低,并且在转移伊始(第17天)骤降。6.在转移肿瘤组织中,S100A6的表达也呈逐步降低趋势。7.外源性rhS100A6抑制VX2的增殖、迁移及兔肝VX2移植瘤模型兔血清和转移肿瘤组织中S100A6的进行性降低,提示:1)S100A6对肿瘤VX2具有抑制性作用;2)S100A6表达的下调可能是促进肿瘤发展的因素之一,因此,上调S100A6的表达可能延缓该发展进程;3)血清S100A6可望成为肿瘤VX2转移的标志物。