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TRA2B (transformer2beta homolog, Drosophila)是一种SR(Serine/Arginine-rich proteins)相关蛋白,主要参与调控前体mRNA剪接,从而调节基因表达。有许多证据表明TRA2B在大脑中广泛分布、参与多种脑生理功能,并与一些脑疾病相关。本论文的总目标是在本课题组以往工作基础上,进一步了解TRA2B在大脑中的可能作用。在第一部分工作中,我们用Western Blot、免疫组织化学和免疫荧光等方法详细分析了成年大鼠脑内不同区域和核团中TRA2B的表达特征,如表达水平、核质分布、细胞类型特异性等。我们在大鼠脑内发现TRA2B蛋白有两种翻译后修饰形式,其中磷酸化形式与其细胞核分布相关联。此外,虽然TRA2B,总蛋白在大鼠脑各个组织广泛分布,但是总蛋白水平在各脑区不同,而且其磷酸化和非磷酸化状态的比例也不同,具有区域特异性。我们还发现TRA2B蛋白的免疫信号广泛存在于神经元细胞中,而在神经胶质细胞中检测不到,说明TRA2B在脑内的表达有细胞特异性。在亚细胞分布上我们还发现TRA2B蛋白在细胞核内呈斑点状分布。我们还发现TRA2B蛋白在嗅球、上丘脑、下丘脑、中脑、小脑浦肯野细胞和颗粒细胞中均有表达。尤其值得注意的是,我们观察到TRA2B在一些核团如前额叶皮层(PFC)、伏隔核(NAc)、中脑腹侧被盖区(VTA)、蓝斑区(LC)、中脑导水管周围灰质(CGD)和被盖脚桥核(RtTg)有着显著表达,这些核团都是已知的与药物成瘾及耐受有着密切联系的区域。这些结果提示了TRA2B与药物成瘾很可能有一定的联系。鉴于TRA2B是一个重要的基因表达调控蛋白,这些发现提示我们TRA2B在这些核团中可能参与某些药物成瘾相关基因表达的调控。为探索这种可能性,我们首先假设：如果TRA2B参与调控药物成瘾相关基因的表达,则TRA2B与受其调控的成瘾相关基因所表达的蛋白在脑内的空间分布应该有一定的相关性。为验证这一点,我们利用免疫荧光技术标记TRA2B蛋白,观察它与一些成瘾相关信号蛋白的共定位情况。我们观察到TRA2B与一个药物成瘾信号因子——RGS4(Regulator of G-protein signaling4)在这些核团中有共分布现象。在大鼠前额叶皮层(PFC)、伏隔核(NAc)、中脑腹侧被盖区(VTA)、蓝斑(LC)这些核团中,几乎所有RGS4阳性细胞中都有TRA2B的表达。TRA2B与RGS4在空间分布上的共存现象提示了两者之间可能存在的关联。根据已有的报道,TRA2B蛋白的主要功能特征是能够结合到靶基因的前体mRNA上,与其他剪接因子构成剪接小体,并帮助识别剪接位点。因此,如果TRA2B蛋白参与调控RGS4的表达,它很有可能会结合RGS4的前体mRNA,并与构成剪接小体的其他蛋白有相互作用。通过分析TRA2B蛋白的免疫沉淀复合物,我们发现其中的确存在RGS4mRNA。同时,通过对TRA2B特异性免疫沉淀复合体的蛋白条带的质谱鉴定,我们发现了另外两个SR蛋白家族成员——ASF/SF2和SRp30c。它们很可能与TRA2B蛋白一起存在于RGS4前体mRNA的剪接小体中,并对RGS4前体mRNA剪接起调控作用。TRA2B与RGS4之间的相互结合作用提示了TRA2B对RGS4可能有调控作用。为了验证这个可能性,接着我们又从细胞水平上研究TRA2B对RGS4的表达是否有调控作用。利用细胞瞬时转染技术和RT-PCR、Western blot分析,我们发现TRA2B过量表达使细胞内源性RGS4mRNA和蛋白水平都升高；而TRA2B表达抑制使RGS4mRNA和蛋白水平都显著降低。而且TRA2B对于RGS4水平的影响还具有浓度依赖性。说明TRA2B的确能够调控RGS4的表达。此外,我们还深入研究了TRA2B蛋白有哪些关键结构是可影响其对RGS4表达的调控功能。鉴于RS结构域(Argnine/Serine-rich domain)决定了SR蛋白的核内分布,而SR蛋白的核内分布情况又与其功能息息相关,因此我们首先通过缺失突变分析观察了TRA2B蛋白的RS1结构域及其突变体对其核内分布的影响。结果显示,TRA2B蛋白在核内speckles的定位依赖于RS1结构域而非RS2结构域,说明两个RS结构域存在差异。此外,在RS1结构域上,我们发现了多个能够引导核内speckle定位的由SR重复序列构成的特殊信号,主要集中在56-68aa、79-89aa、89-99aa这几个区段中。这些信号互相冗余,但是多个同时存在能使定位更加严格。根据文献报道,成瘾药物能够影响相关核团中RGS4的表达水平。我们以上的结果发现TRA2B在药物成瘾相关核团高表达并与RGS4共定位,并且TRA2B能够结合RGS4mRNA并调控其表达水平,即TRA2B表达增高可增加RGS4的表达,反之,使之下降。因此,我们推测：如果TRA2B参与或介导了成瘾药物刺激引起的RGS4表达变化,那么在成瘾情况下,成瘾相关核团中的TRA2B和RGS4的表达水平变化也有类似的相关性。为了验证这一推测,我们研究了成瘾药物——吗啡刺激对TRA2B的影响。结果发现,与注射生理盐水的对照组相比,急性吗啡刺激使大鼠蓝斑区中TRA2B和RGS4蛋白含量降低,而慢性吗啡刺激使大鼠蓝斑区TRA2B和RGS4蛋白含量升高,阿片受体拮抗剂纳洛酮可以抑制由吗啡刺激引起的TRA2B和RGS4蛋白表达量的变化。这种变化的一致性提示TRA2B很有可能作为调控RGS4表达的上游基因参与成瘾药物刺激引起的RGS4蛋白水平变化,即通过调控RGS4表达而参与药物成瘾过程。综上所述,我们的工作围绕着TRA2B调控药物成瘾相关因子RGS4的表达及其机制这一方向,进行了一些研究,发现了在药物成瘾相关核团中TRA2B和RGS4蛋白的共分布,在细胞模型中证明了TRA2B对RGS4的调控作用,并从TRA2B蛋白结构方面研究了此种调控作用的机制。此外,这种细胞模型中观察到的TRA2B对RGS4的调控作用所呈现的TRA2B和RGS4蛋白变化的相关性也存在着于成瘾药物刺激下的大鼠脑内的成瘾相关核团中。这些结果提示,作为一个在大脑中具有复杂功能的剪接调节因子,TRA2B很有可能通过调节药物成瘾相关因子RGS4基因的表达,参与到药物成瘾信号通路中。