鸭圆环病毒和禽流感病毒重组酶介导恒温核酸扩增快速诊断方法的建立

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由鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)和禽流感病毒(Infectious laryngotracheitis virus,AIV)引起的鸭圆环病毒病(Duck circovirus disease,DuCVD)及禽流感(Avian influenza,AI)因其容易传播、难以防控和临床危害大的特点,对养殖户造成严重的经济损失。误诊和迟诊加剧了疫病带来的危害,因此,先进的检测技术对疫病的防控尤为重要。重组酶介导的扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)与反转录重组酶介导的核酸技术(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)是一种新型的能够在恒温条件下进行体外核酸扩增的技术,自问世以来己经被应用于多种病原微生物的检测当中。本研究在RAA的基础上,通过设计特异性的引物和探针,针对AIV和DuCV建立了两种快速恒温核酸扩增检测方法,分别是将RAA/RT-RAA与侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术相结合,建立的重组酶介导核酸扩增-侧向流试纸条(recombinase-aided amplification/reverse transcription recombinase-aided amplification-lateral flow dipstick,RAA-LFD/RT-RAA-LFD)的检测方法和将RAA/RT-RAA与exo探针结合的实时荧光重组酶介导的扩增(real-time fluorescence based recombinase-aided amplification/reverse transcription recombinase-aided amplification,RF-RAA/RF-RT-RAA)检测方法。同时,对所建立的诊断方法进行反应温度、反应时间等条件的优化,并在最优条件下检测反应的灵敏性,验证引物和探针的特异性,通过对临床样本进行检测比较两种方法的符合率。结果如下:1、建立了 DuCV的两种检测方法,RAA-LFD在37℃条件下,反应20 min即可达检测水平,模板的最低检出限为100拷贝/μL。对40份临床样本进行检测,以PCR-琼脂糖凝胶电泳法为基准,符合率为92.50%。RF-RAA在41℃条件下,15 min 即可完成反应,最低检测浓度为可达1拷贝/μL。对52份临床样本进行检测,以RFQ-PCR为基准,符合率为98.08%。两种方法的特异性好,与其他常见病毒核酸无交叉反应。2、建立了 AIV的两种检测方法,RT-RAA-LFD在37℃条件下,反应24 min即可达检测水平,且本方法能够检测到的最低模板浓度为100拷贝/μL。对58份临床样本进行检测,以RT-PCR-琼脂糖凝胶电泳法为基准,符合率为94.83%。RF-RT-RAA在42℃条件下,反应20 min即可完成反应,最低检测浓度为可达10拷贝/μL。对55份临床样本进行检测,以RFQ-PCR为基准,符合率为100%。两种方法的特异性好,与其他常见病毒核酸无交叉反应。结果表明,基于RAA/RT-RAA技术建立的两种关于DuCV和AIV的检测方法的灵敏性高、特异性好。其中RAA-LFD/RT-RAA-LFD实现了结果的可视化,能够满足条件有限的基层临床使用;RF-RAA/RF-RT-RAA的灵敏性更高,能满足实验室检测的要求。两种检测方法为DuCV和AIV的检测提供了一种新的检测手段,对DuCVD与AI的防控有积极意义。
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