【摘 要】
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干扰素为绿色高效、可替代抗生素的新型生物兽药,其具有抗病毒、调免疫等功能。不同种类干扰素以及干扰素与防御素、白介素等串联表达,是否可以发挥各自的作用?基于此,本研究通过基因工程技术,以PoIFNα为骨架,串联具有不同活性的IFNλ1、IL-2和pBD2蛋白,分析重组后融合蛋白的抗病毒、免疫以及抑菌活性。本研究根据GenBank中猪α干扰素（PoIFNα）、猪白介素2（IL-2）、猪λ1干扰素（Po
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干扰素为绿色高效、可替代抗生素的新型生物兽药,其具有抗病毒、调免疫等功能。不同种类干扰素以及干扰素与防御素、白介素等串联表达,是否可以发挥各自的作用?基于此,本研究通过基因工程技术,以PoIFNα为骨架,串联具有不同活性的IFNλ1、IL-2和pBD2蛋白,分析重组后融合蛋白的抗病毒、免疫以及抑菌活性。本研究根据GenBank中猪α干扰素（PoIFNα）、猪白介素2（IL-2）、猪λ1干扰素（PoIFNλ1）和猪β-防御素（pBD）的天然基因序列,通过在线网站对序列进行生物信息学分析,去除信号肽序列,保留成熟蛋白的基因序列。并且在不改变氨基酸序列的条件下,将基因序列优化为大肠杆菌偏嗜密码子,后送至生物公司进行合成,均克隆至pET32a载体上。首先,本研究分别构建了 6个原核表达载体（pET32a-PoIFNα、pET32a-PoIFNα+IL-2、pET32a-PoIL-2、pET32a-PoIFNλ1、pET32a-PoIFNα+λ1、pET32a-pBD2+IFNα）和真核表达载体pPICzαA-pBD2+IFNα,表达的蛋白依次命名为rPoIFNα、rPoIFNα+IL-2、rPoIL-2、rPoIFNλ1、rPoIFNα+λ1、rppBD2+IFNα 和repBD2+IFNα。之后对各个重组蛋白进行诱导表达和纯化;在PK15细胞上,利用MTT法和细胞病变抑制法测定重组蛋白的细胞毒性和抗VSV活性;通过实时荧光定量PCR测定了重组蛋白作用PK15细胞不同时间点干扰素刺激基因的变化;为测定rPoIFNα+IL-2蛋白和rpBD2+IFNα蛋白融合部分的活性,针对IL-2我们设计测定了重组蛋白作用猪外周血淋巴细胞后,淋巴细胞的转化率和相关因子的表达水平;针对pBD2,我们采用琼脂扩散法和细菌生长曲线法测定其抑菌活性。最后用重组蛋白治疗PRV感染的小鼠,测定给药后3、5、7天血清细胞因子的含量,观察记录各组小鼠临床症状和死亡情况,测定小鼠脑、肝脏和脾脏的病毒载量。试验结果表明,无论是真核还是原核重组蛋白,经MTT法检测后,在一定范围内均未对PK15细胞造成损伤,后经细胞病变抑制法测定,可以发现重组蛋白在体外显示出强大的抗VSV和PRV病毒的活性;在作用PK15细胞6-12h时,均使ISG有不同程度的表达,这也进一步验证了蛋白的抗病毒活性;将IL-2与PoIFNα串联后,与单体rPoIL-2和rPoIFNα相比,既保留了干扰素的活性,又增加了 IL-2的免疫调节和促进淋巴细胞增殖分化的能力,显著上调IFN、γTGFβ、TNFα的基因水平;同样,重组rppBD2+IFNα和repBD2+IFNα蛋白增加了抑菌活性。用重组蛋白治疗PRV感染的小鼠后,能显著改善小鼠的临床症状和死亡情况,各组织器官的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究基于猪α干扰素获得7个基因重组蛋白,经体外检测,不仅对细胞没有损伤作用,还具有抗VSV和PRV病毒增殖的活性。通过测定融合部分蛋白的活性,我们发现,两种蛋白融合后会保留相应的活性;在体内,将重组蛋白用于PRV感染的小鼠,结果发现,蛋白治疗组能显著改善小鼠的临床症状,减低死亡率,且各组织器官的病毒载量明显低于PRV感染组。这为后续重组融合蛋白活性的测定和体内评价提供基础,为临床上研发无毒、安全、无残留的新型蛋白类药物提供方向和思路。
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