研究发现适量、适时的外源钙处理可促进荷叶铁线蕨配子体雌性性器官的分化及颈卵器数量的增多,透射电镜观测结果显示,经外源钙处理后的配子体胞内钙离子含量明显高于未经外源钙处理的配子体,钙离子主要分布于细胞膜边缘,这表明外源钙在配子体性器官形成和分化中起到了促进和调节作用。研究中还发现,经外源钙处理的配子体的部分后代可以产生多孢子体,它们即可通过不同位置的叶缘细胞进行无配子生殖形成单倍的孢子体,同时又可以在性器官形成区,通过有性生殖形成二倍的孢子体,而其体细胞胚形成及发育都处于生殖隔离状态。在基因水平上,运用MSAP技术,探讨DNA甲基化在荷叶铁线蕨配子体性器官分化及无配子生殖的胚胎发育中的作用。MSAP分析结果显示,荷叶铁线蕨基因组中约有26-30%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化。1)经外源钙处理的同源配子体所形成的无性器官分化、有性器官形成与经外源钙处理后可产生多颈卵器的配子体：配子体性器官形成前后及多性器官形成时,甲基化比例均呈上升的趋势,在多性器官形成时达到最高,甲基化率与性器官数量呈明显线性相关,这与HPLC分析结果一致。产生多性器官的配子体其基因组超甲基化率与去甲基化率均明显增高。回收差异条带中与钙离子信号传导相关的WAK及WRKY转录因子同源性较高的较多。2)无配子生殖产生多孢子体的胚胎发育过程中,无胚组织时DNA总甲基为19.2%,胚性细胞团时DNA总甲基化水平下调至17.9%,胚芽时DNA总甲基化水平上调至20.1%,芽点时又下调至19.5%。超甲基化率最高的阶段是无胚组织到胚性细胞团,最低的为无胚组织到芽点；去甲基化率最高的也是无胚组织到胚性细胞团,最低的是无胚组织到胚芽,这表明DNA甲基化在胚胎发育不同时期具有特异性。本研究结果表明荷叶铁线蕨的性别分化和胚胎发育与DNA甲基化密切相关,为深入探讨DNA甲基化对相关基因的表达调控机理奠定了基础。