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羧肽酶B属于金属羧肽酶家族,活性中心含有锌离子,主要特异性催化水解蛋白质和多肽C-末端碱性氨基酸残基,残基主要为精氨酸和赖氨酸。羧肽酶原B含有402个氨基酸,由95个氨基酸的前肽和307个氨基酸的酶体组成。鼠源羧肽酶原B在原核表达体系中以包涵体形式表达,其结构含有3对二硫键和1个游离半胱氨酸。
本论文采用定点突变的方法,将半胱氨酸用其它氨基酸代替以减少二硫键错配几率,从而提高包涵体复性效率。在提高突变体复性率的同时还对突变体进行纯化及性质研究以进一步了解羧肽酶B结构与功能的关系。另外,本论文还对鼠源羧肽酶原B的N端及C端截短体所形成的包涵体进行复性研究,为后续课题打下基础。
突变鼠源羧肽酶原B游离半胱氨酸Cys383,构建突变体C383G,C383A,C383R,C383E,C383L,C383Y高效表达菌株。其中,突变体C383G及C383A与野生型相比复性率均有所提高,而突变体C383R,C383E,C383L,C383Y则无法成功复性。对纯化后突变体C383G及C383A进行酶学性质研究,结果表明突变体C383G及C383A催化效率及温度稳定性比野生型高,但与底物的亲和力比野生型低。
将鼠源羧肽酶原B二硫键Cys230-253的两个Cys均突变为GIy,构建突变体C230G/C253G高效表达菌株。将二硫键Cys158-Cys171的Cys171突变为Ala,构建突变体C171A高效表达菌株。结果表明突变体C230G/C253G完全无法复性,而突变体C171A虽可以完成复性过程,但复性率要低于野生型,并且复性条件与野生型相比也有所不同。对纯化后的突变体C171A进行酶学性质研究以确定二硫键Cys158-Cys171的功能,结果表明鼠源羧肽酶B缺失二硫键Cys158-Cys171后,其酶学性质受到较大影响。突变体C171A的pH和温度稳定性及最适pH与野生型相比均有所变化,突变体C171A的Km值明显高于野生型,表明催化效率的kcat/Km值突变体C171A也明显要低。另外,金属离子及EDTA对突变体C171A活性的影响也大于其对野生型的影响。
对鼠源羧肽酶原B的N端进行截短,分别构建截短前肽5个氨基酸及12个氨基酸截短体N5aa及N12aa,以研究前肽对包涵体复性的影响。结果表明截短体N5aa,N12aa的复性率均低于野生型。另外,对C末端α螺旋截短结果表明截短体C26aa所形成的包涵体完全无法复性。
此结果说明Cys383所在的C末端α螺旋结构在包涵体的复性过程中起关键作用。