Polo样蛋白激酶1（Polo-like kinase 1,PLK1）是人类多种细胞有丝分裂中G2/M期的启动者,其功能主要是对细胞周期进行调控,包括促进中心体成熟、纺锤体组装、染色体分离及胞质分裂等。临床前研究结果表明,PLK1异常高表达与人类多种肿瘤相关,是肿瘤细胞生长与增殖的必需基因。阻断PLK1相关通路,能有效抑制肿瘤细胞增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡,因此PLK1已成为一个颇具吸引力的肿瘤治疗靶点。其中,以PLK1为靶点的抑制剂也已成为急性髓系白血病治疗的创新疗法。但多项关于PLK1抑制剂在临床试验中的结果显示:在使用该类抑制剂进行肿瘤靶向治疗时约10%～70%的患者会出现明显贫血,有些甚至为中、重度贫血。然而截止目前,PLK1抑制剂引起贫血的具体原因和机制尚未明确。红系发育是一个多阶段但精密调控的过程,包括造血干细胞逐步定向分化生成红系祖细胞BFU-E和CFU-E的早期发育阶段,CFU-E细胞持续分化为形态上可辨的原始红、早幼红、中幼红以及晚幼红细胞的终末红系分化,以及网织红细胞成熟阶段。在这一有序的发育分化过程中伴随着细胞周期的运转、膜组织的重构、细胞体积的减小、染色质浓缩的增强和血红蛋白的进行性变化等。其中任何一个发育阶段的失调都会造成正常红细胞生成障碍而引起贫血的发生。那么,PLK1在红系发育进程中的功能是什么?其抑制剂又是通过影响红系发育中的哪些过程而导致贫血的发生呢?这亟需我们的探索。我们首先用红白血病细胞株K562验证两种PLK1抑制剂GSK461364和BI6727（Volasertib）在肿瘤细胞中的作用。药物处理24h后发现K562细胞增殖受阻,其凋亡率显著增加。由于K562细胞株可被血红素（Hemin）诱导向早期红细胞分化,故常常被用于红细胞早期分化研究。K562细胞系中添加两种PLK1抑制剂,药物处理24h后添加Hemin诱导其向红系分化,实验结果表明:PLK1抑制剂处理显著抑制K562细胞的增殖并引发凋亡,且细胞凋亡率明显高于未诱导细胞;但PLK1抑制剂处理并不影响K562细胞向红系定向分化。K562虽可作为研究红系早期分化的良好模型,但其具有一定的局限性,不能对完整的红系发育进程进行精细研究。为了寻求PLK1抑制剂和红细胞生成障碍之间的关系,我们进一步利用体外人外周血CD34+造血干细胞定向红系发育培养体系进行研究。红系培养体系第2天向CD34+细胞中分别添加两种PLK1抑制剂,结果显示添加PLK1抑制剂显著抑制红系细胞的增殖并诱导细胞凋亡;流式细胞术检测显示PLK1抑制剂显著影响红系祖细胞分化,将细胞阻滞于BFU-E阶段而不向CFU-E分化;进而延迟终末分化进程,抑制红细胞的脱核。接下来,我们选取BI6727对野生型小鼠进行腹腔注射以进一步探究PLK1在体内造血发育的影响。小鼠腹腔注射BI6727（25mg/kg）连续两周（一周一次）后进行外周血血常规检测,结果发现其红细胞数目、血红蛋白含量等明显低于对照组,提示PLK1抑制剂注射后诱导小鼠出现贫血症状。为了探究贫血原因,我们用流式细胞术检测了小鼠注射PLK1抑制剂后骨髓造血干细胞到终末红细胞生成各阶段细胞数量变化。结果表明,PLK1注射组小鼠造血干细胞HSC和多能祖细胞MPP增多,髓系祖细胞CMP,粒系/单核系祖细胞GMP,巨核系/红系祖细胞MEP降低,但不影响淋巴系祖细胞CLP。此外,克隆形成实验进一步检测小鼠红系祖细胞BFU-E和CFU-E的集落形成能力,与体外结果相一致的是,红系祖细胞BFU-E出现积累,数量变多,而CFU-E数量减少,并且明显低于对照组。骨髓终末红细胞检测结果表明Ter119+红细胞比例和数量均显著下降,红系终末分化受阻。另外,实验组小鼠脾脏体积明显增大,脾重增加,脾脏活细胞数显著升高,流式结果表明脾脏有核红细胞数量显著增加,提示小鼠注射PLK1抑制剂后脾脏出现代偿性造血。此外,流式结果显示PLK1抑制剂并不影响骨髓巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞及T/B细胞的发育。综上所述,本课题利用K562细胞系、体外CD34+定向诱导红系分化体系及小鼠体内实验系统探索了PLK1在体内外红系发育进程中的功能,发现PLK1的抑制可以导致细胞增殖障碍、细胞凋亡增加、造血干祖细胞稳态失调、红系祖细胞BFU-E的阻滞及红系终末分化受损等;其中红系祖细胞BFU-E的阻滞导致的红系分化障碍可能是临床上以PLK1为靶点的抑制剂诱导贫血的重要原因。该课题的完成明确了PLK1在红系发育中的重要功能,揭示了PLK1为靶点的抑制剂诱导贫血的原因,为今后临床上预防和治疗由于PLK1抑制剂引起的贫血提供理论依据,也进一步为临床上肿瘤分子靶向药的开发和联合用药提供了新的思路和指导。