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目的:应用携带沉默信息调节因子1(Silent information regulator1,SIRT1)沉默基因或过表达基因的慢病毒分别转染小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(TypeⅡ alveolarepithelium cells,AECs-Ⅱ)后,观察百草枯(paraquat,PQ)干预后核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor-2,NRF2)蛋白表达水平及其蛋白稳定性和去乙酰化水平,及细胞的氧化应激状态和细胞凋亡情况的变化,探讨SIRT1去乙酰化NRF2对PQ中毒引起的小鼠ACEs-Ⅱ肺损伤的保护作用,为百草枯中毒肺损伤的抗氧化治疗提供理论依据。 方法: 实验一:低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法提取小鼠AECs-Ⅱ,免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色法鉴定所提取细胞。构建携带SIRT1基因沉默及SIRT1基因过表达的慢病毒载体,转染小鼠ACE-Ⅱ,通过绿色荧光(GreenFluorescent Protein,GFP)表达量和蛋白免疫印迹(Western-blot)法检测SIRT1的表达情况验证慢病毒载体的转染效率。 实验二:转染慢病毒的小鼠AECs-Ⅱ在800μM百草枯作用24h后,Western-blot法检测SIRT1和NRF2表达变化,IF法检测NRF2核内表达情况,免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)检测NRF2乙酰化水平的改变情况,放线菌酮(Cycloheximide,CHX)检测NRF2蛋白表达的稳定性,化学比色法检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的变化,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,Elisa)法检测血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase1,HO-1)活性变化,流式细胞仪和末端标记(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling, TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。 结果: 1.免疫荧光染色鉴定证实所提取的细胞为小鼠AECs-Ⅱ。荧光显微镜下观察到,在感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)为80的转染条件下,慢病毒对小鼠AECs-Ⅱ的转染效率为90%以上。Western-blot法结果显示,与Control组相比,空载体组的SIRT1蛋白表达量没有明显差异,统计学没有意义(p>0.05);而siRNA-Sirt1组的SIRT1蛋白表达量显著减少,LV-Sirt1组的SIRT1蛋白表达量显著增高,差异均具有统计学意义(p<0.05)。 2.Western-blot检测法结果显示:与Control组相比,PQ组、PQ+siRNA-Sirt1组SIRT1蛋白表达量明显降低,PQ+LV-Sirt1组SIRT1蛋白明显升高;与PQ组相比,PQ+siRNA-Sirt1组SIRT1蛋白表达明显降低,但是PQ+LV-Sirt1组SIRT1蛋白表达显著升高,差异均具有统计学意义(p<0.05)。 3.IF结果显示:与Control组相比,siRNA-Sirt1组AECs-Ⅱ细胞核内NRF2蛋白表达水平明显降低,但是LV-Sirt1组细胞核内NRF2蛋白表达水平显著升高。 4.NRF2去乙酰化检测结果显示:与Control组相比,siRNA-Sirt1组细胞内NRF2蛋白乙酰化水平明显增高,而LV-Sirt1组细胞内NRF2蛋白乙酰化水平明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。 5.NRF2稳定性检测结果显示:与Control组相比,PQ组、PQ+siRNA-Sirt1组及PQ+LV-Sirt1组NRF2蛋白稳定性明显降低,差异均具有统计学意义(p<0.05);与PQ组相比,PQ+siRNA-Sirt1组NRF2蛋白稳定性明显降低,而PQ+LV-Sirt1组明显升高,差异均具有统计学意义(p<0.05)。 6.氧化应激检测结果显示:与Control组相比,PQ组、PQ+siRNA-Sirt1组及PQ+LV-Sirt1组SOD、GSH、CAT含量明显降低;与PQ组相比,PQ+siRNA-Sirt1组SOD、CAT活性及GSH含量明显降低,而PQ+LV-Sirt1组显著升高,差异均具有统计学意义(p<0.05)。与Control组相比,PQ组、PQ+siRNA-Sirt1组及PQ+LV-Sirt1组MDA含量和HO-1活性明显升高;与PQ组相比,PQ+siRNA-Sirt1组MDA含量明显升高,PQ+LV-Sirt1组明显降低,但是PQ+siRNA-Sirt1组HO-1活性明显降低,而PQ+LV-Sirt1组显著升高,差异均具有统计学意义(p<0.05)。 7.流式细胞仪检测凋亡结果显示:与Control组相比,PQ组、PQ+siRNA-Sirt1组及PQ+LV-Sirt1组AECs-Ⅱ细胞凋亡率明显提高,差异具有统计学意义(p<0.05);与PQ组相比,PQ+siRNA-Sirt1组细胞凋亡率明显提高,PQ+LV-Sirt1组细胞凋亡率显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。 8.TUNEL法检测结果显示:与Control组相比,PQ组、PQ+siRNA-Sirt1组及PQ+LV-Sirt1组AECs-Ⅱ TUNEL染色阳性细胞明显增多,差异具有统计学意义(p<0.05);与PQ组相比,PQ+siRNA-Sirt1组AECs-ⅡTUNEL染色阳性细胞显著增加,PQ+LV-Sirt1组染色阳性细胞凋亡明显减少,差异具有统计学意义(p<0.05)。 结论: SIRT1去乙酰化NRF2,增加NRF2的稳定,同时促进NRF2向核内转运,促进了NRF2的转录活性,使其下游的SOD、GSH等抗氧化酶表达提高,增强了细胞对氧化损伤的抗性,对百草枯中毒引起的小鼠AECs-Ⅱ损伤起保护作用。