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本研究运用分子生物学基本技术,扩增目的序列,构建pGEX-SOHLH1融合表达质粒,并运用IPTG诱导目的蛋白表达。通过纯化包涵体,对包涵体内蛋白透析复性,用GST Bind Resin亲和层析纯化获得重组蛋白。最后运用靶序列循环扩增(The Cyclic Amplification of Sequence of Target,CAST)实验来确定SOHLH1的DNA结合序列。对生殖细胞特异转录因子sohlhl DNA结合序列的分析为进一步研究精卵发生中SOHLH1的表达调控和后续精卵发生中的基因表达调控过程奠定基础。另一方面还为我们对精原卵原细胞早期分化过程进行人为干扰提供了选择,通过人为的干扰可以获得一些不孕不育的动物模型,从而为生殖医学技术的发展提供新的研究思路。
方法：
本实验通过PCR的方法,扩增并回收SOHLH1蛋白中螺旋环螺旋结构域基因序列,将目的片段插入到原核表达质粒pGEX-4T-2的GST基因下游,构建GST-SOHLH1融合表达质粒,并转化Rosetta-gami(DE3)Plys表达菌株。通过酶切鉴定及DNA测序筛选正确的融合表达载体。通过在不同温度、不同IPTG终浓度及不同诱导时间条件下对诱导菌体聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的分析,得出最佳诱导条件。在最适条件下对菌体进行诱导,经裂解、透析复性得到溶解蛋白,该蛋白经GST Bind Resin亲和层析,获取纯化后的GST-SOHLH1蛋白,并对蛋白进行Western Blot鉴定。鉴定后的GST-SOHLH1蛋白用于CAST实验,通过比对CAST实验得到的PCR产物的序列,得出SOHLH1蛋白的DNA结合序列。
结果：
1、PCR扩增得到的Sohlh1基因片段酶切后与pGEX-4T-2连接。通过酶切及DNA测序证实目的片段成功插入到表达载体中。
2、经验证重组质粒在37℃、IPTG终浓度1mMol/L,诱导3小时时融合蛋白表达量最高,GST-SOHLH1融合蛋白分子量约为36KDa。
3、GST-SOHLH1蛋白以包涵体形式存在,经裂解、透析复性得到溶解蛋白,该蛋白经GST Bind Resin亲和层析,获取纯化后的GST-SOHLH1蛋白。
4、DNA序列GACTT/G/CA出现频率最高,可能是SOHLH1的结合序列。
结论：
1、成功构建插入小鼠SOHLH1蛋白螺旋环螺旋结构域基因序列的重组原核表达质粒pGEX-SOHLH1。
2、经CAST实验证明DNA序列G A C T T/G/C A可能为转录因子SOHLH1的特异结合序列。