论文部分内容阅读
目的:研究端粒酶抑制剂MST-312对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响并探讨其作用机制。材料和方法:应用MTT法对MST-312的细胞毒性进行检测,筛选合适的药物浓度;选取X射线2 Gy对MST-312预处理的细胞进行辐照后,采用克隆形成实验检测细胞存活率,观察MST-312对细胞的辐射增敏性的影响;分别采用流式细胞仪和Hoechst 33258荧光染色法对辐照后细胞周期以及凋亡情况进行检测;Western blot法检测细胞损伤、修复及凋亡相关蛋白表达水平的变化;应用Real-time fluorescent quantitative PCR技术检测细胞内端粒酶活性;激光共聚焦显微镜观察γ-H2AX、XRCC4和Rad51在细胞内的分布及数量,衡量DNA损伤程度及修复情况;利用靶向性探针JC-1对线粒体的膜电势丢失情况进行检测。结果:1.MTT法的结果显示MST-312对HepG2细胞增殖抑制作用呈剂量依赖性,4 μM的MST-312对HepG2细胞的增殖抑制率较小,而且对细胞的形态没有明显影响;克隆形成实验结果显示,药物+辐照组的克隆形成率较单独辐照组明显降低;经流式细胞术分析,辐照后12 h能够引起显著G2/M期阻滞,但随着时间延长至24 h,与单独辐照组相比,药物+辐照中阻滞于G2/M期的细胞比例下降、同时Sub-G1细胞比例上升;Hoechst 33258荧光染色表明,在辐照后24 h,与单独辐照组相比,药物+辐照组中HepG2细胞出现了更加明显的凋亡形态变化;除此之外,辐照后24 h,药物+辐照组γ-H2AX蛋白表达量高于单独辐照组,此结果提示DNA损伤严重,未完全修复。2.通过Real-time fluorescent quantitative PCR分析得出,2 Gy的X射线上调hTERT的1nRNA表达,而MST-312能够有效地抑制HepG2细胞的内在和辐射诱导的hTERT的mRNA表达,即端粒酶活性;激光共聚焦显微镜观察到MST-312与X射线联合处理的细胞中存在着大量的γ-H2AX焦点,但同源重组修复(homologous recombination repair, HR)蛋白Rad51焦点被大量聚集在细胞核外;JC-1结果显示,与单独辐照组相比,药物+辐照组细胞内绿色荧光强度/红色荧光强度的比值升高,线粒体膜电势△ψm损失更为严重;Western blot的结果显示,与单独辐照组相比,药物+辐照组的p53蛋白表达增加、Bcl-2/Bax比值和caspase-3蛋白酶原表达量都有所降低。结论:端粒酶抑制剂MST-312对人肝癌HepG2细胞具有显著的辐射增敏作用;增敏作用机制与MST-312抑制端粒酶活性而引起端粒酶功能异常和影响DSBs修复的HR途径有关;MST-312不仅增加了辐射诱导的DNA损伤,而且影响了损伤DNA的修复,使得HepG2细胞通过p53依赖的线粒体途径走向凋亡。