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肺癌是发病率最高的恶性肿瘤之一,发病进程复杂,治疗方案多样。非小细胞肺癌作为最常见的肺癌类型,主要的治疗方法包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗。然而,仅有一小部分早期患者可以接受手术治疗,其他治疗手段也常因适应症不足或临床耐药而效果不佳。能量代谢重编程是目前肺癌研究的一个重要方向,肺癌组织与正常肺组织利用能量方式的差异在其发生发展中发挥了关键作用,但尚未开发出针对这一靶点的有效临床药物。因此,运用已知临床药物库,通过高通量筛选,研发靶向肿瘤能量代谢的新药为非小细胞肺癌的治疗提供了新的思路。本研究利用生物信息学方法,通过对肺癌及其癌旁组织的RNAseq数据进行差异表达分析及通路富集分析,发现氧化应激、PI3K-Akt等信号通路存在明显差异。鉴于ROS与PI3K-Akt通路均与线粒体功能密切相关,以及能量代谢重编程在肿瘤发生发展中的重要作用,本研究利用文献计量学的方法分析肿瘤能量代谢的研究现状。结果显示,肿瘤能量代谢领域的研究在近年来得到快速发展,但尚未被彻底研究。继而利用FDA药物库,初步筛选出对NCI-H1975肺癌细胞系有抑制作用的42种药物。其中Mubritinib是一种潜在的靶向线粒体功能的抑制剂,目前尚未见其抑制肺癌的相关报道,因此选择Mubritinib作为备选药物进行后续的研究。为明确Mubritinib对非小细胞肺癌细胞的抑制作用,本研究通过细胞增殖实验,发现Mubritinib对非小细胞肺癌细胞有明显的抑瘤活性,且该效应与Mubritinib的剂量和作用时间呈正相关。继而在细胞凋亡检测中发现,Mubritinib处理后细胞发生明显凋亡,且随着Mubritinib浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加,由此推测Mubritinib可促进NCI-H1975细胞凋亡,并降低恶性肿瘤逃避程序性死亡的能力。进一步应用PI单染流式细胞术检测细胞周期,发现Mubritinib处理后,NCI-H1975细胞的G2期细胞比例明显增高,G0G1期细胞比例明显降低,提示细胞发生了G2期阻滞,可能是Mubritinib将NCI-H1975细胞阻滞于G2期,使细胞内的RNA和蛋白质合成受到抑制,细胞无法进入M期,因此无法进行增殖。细胞划痕实验的结果表明,Mubritinib阻止了NCI-H1975细胞横向迁移以及划痕愈合的能力;Transwell实验的结果则显示,NCI-H1975细胞的侵袭能力被Mubritinib所抑制,经Mubritinib处理的细胞无法分泌充足的MMPs溶解Matrigel胶而实现侵袭。并且随着Mubritinib药物浓度的增加,对细胞迁移和侵袭能力的抑制作用增强,表现出明显的浓度依赖性。简而言之,Mubritinib可促进NCI-H1975细胞凋亡,抑制NCI-H1975细胞增殖,阻滞细胞的增殖周期,进而导致NCI-H1975细胞的活力下降,抑制肿瘤细胞的增长。同时Mubritinib可抑制NCI-H1975细胞的侵袭和迁移能力,限制肿瘤细胞的转移。以上结果提示,Mubritinib可能成为肺癌治疗的候选药物。为了验证Mubritinib抑制非小细胞肺癌细胞的分子靶标,本研究对Mubritinib处理后的NCI-H1975细胞与未处理的NCI-H1975细胞分别进行了RNA测序。DEGseq分析结果显示,Mubritinib处理后,肺癌细胞中改变最明显的基因是硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP),该基因编码硫氧还原相互作用蛋白,与细胞活性氧的产生和氧化应激密切相关,并进一步影响细胞凋亡的进程。KEGG富集分析结果显示,Mubritinib可在多种细胞进程中对多个基因通路产生影响,其中最引人注意的是PI3K-Akt通路,该通路已被证实与多种癌症和实体瘤的恶性转化、生长和增殖相关,并被认为是肺癌治疗的显著靶点。为了验证RNA测序的结果,本研究通过体外实验,得到以下研究发现:(1)Mubritinib可降低人肺腺瘤NCI-H1975细胞PI3K及p-ERK的表达,阻滞细胞PI3K-Akt-m TOR及PI3K-MEK-ERK等控制生长增殖的信号通路;(2)80 n M和160 n M的Mubritinib可显著提高NCI-H1975细胞的ROS水平,诱导细胞发生氧化应激;(3)Mubritinib可影响NCI-H1975细胞的线粒体呼吸链复合酶活性,并使线粒体膜电位显著下降,导致线粒体功能异常。这些结果表明,Mubritinib可能通过PI3K-Akt-m TOR及PI3K-MEK-ERK信号通路,抑制非小细胞肺癌的线粒体功能,导致细胞内产生氧化应激,进而导致细胞损伤。为了明确Mubritinib是否促进顺铂的抑瘤作用,本研究将Mubritinib与顺铂联合应用,发现二者联合对非小细胞肺癌NCI-H1975的增殖抑制率较单独给药组明显提高,提示Mubritinib和顺铂有抗肿瘤的协同作用,联合使用Mubritinib可降低顺铂剂量而达到高剂量顺铂对NCI-H1975细胞的增殖抑制作用,并降低高剂量化疗对机体的毒副作用。侵袭实验结果显示,联合用药后细胞的侵袭能力受到明显抑制,但对细胞周期的影响与单独用药组相比无明显差异。Mubritinib联合顺铂显著降低了NCI-H1975细胞内的线粒体膜电位,提高了ROS水平,ROS的过度产生可能导致氧化应激进而导致细胞凋亡。通过体内实验观察移植瘤的组织形态学改变,发现联合组移植瘤的组织形态变化尤为突出,组织结构破坏明显,肿瘤细胞出现不同程度的破裂。TUNEL染色结果显示,移植瘤细胞凋亡的数量以联合组最为显著。免疫组织化学染色检测发现,Mubritinib联合顺铂可明显下调Ki67的表达,表明二者联合应用可抑制肺癌移植瘤细胞的增殖。为验证PI3K-Akt-m TOR信号通路的活化,本研究通过免疫组织化学染色方法检测PI3K、Akt、4EBP1的表达水平。结果显示,该信号通路相关蛋白的表达在联合组最低,提示Mubritinib联合顺铂应用更加显著地抑制了PI3K-Akt-m TOR通路的活化。因此推测,Mubritinib抑制非小细胞肺癌的作用机制,可能是通过抑制PI3K,减少Akt的磷酸化激活,下调m TOR的表达,进而调控肺癌细胞下游蛋白的磷酸化,控制肿瘤细胞的存活和凋亡。综上所述,本研究利用FDA批准的药物小分子库,筛选得到对非小细胞肺癌具有明显抑制作用的药物Mubritinib,并进一步通过体内外实验进行了验证了Mubritinib对非小细胞肺癌的抑制作用,并阐明Mubritinib抑瘤作用的可能机制是抑制PI3K-Akt-m TOR通路的活化,进而抑制线粒体功能,诱导ROS的产生,从而发挥抗瘤作用。同时,Mubritinib与顺铂联合应用对非小细胞肺癌具有协同抑制效果。