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植酸盐 (phytate，myo-inositol hexophosphate) 是植物种子中肌醇的主要来源和磷的主要储存形式，同时也是单胃动物中的一种抗营养因子，是动物粪便中磷污染物的重要来源。植酸酶(EC．3．1．3．8)是组氨酸酸性磷酸酶的一个亚类，催化水解植酸盐释放肌醇和无机磷酸。由于植酸酶这种极具应用价值的催化特性，人们为获得经济廉价的植酸酶用于动物饲料添加剂而作出很大的努力。目前已筛选得到许多产植酸酶的物种，包括植物、动物和微生物(特别是真菌和细菌)。
目前，许多已报道的植酸酶基因主要是通过筛选DNA文库或cDNA文库分离得到的。这种方法需要通过PCR扩增获取目的基因的一段序列或通过测定植酸酶蛋白的部分氨基酸序列来设计杂交探针，也有通过表达来筛选基因文库的报道。然而，这种方法相对而言费时费力。
本文构建了一种通过CODEHOP PCR 和 TAIL-PCR联用克隆植酸酶基因的方法。选取10个已发表的来源于不同种属的真菌组氨酸酸性磷酸酶类植酸酶家族的蛋白(HAPs)序列，Clustal W 比对后选取适合引物设计的保守区 (blocks)，应用CODEHOP程序设计一对引物CODE1和CODE2。以Aspergillus niger 和Aspergillus oryzae 的总RNA分别反转录获得其所表达基因的第一链cDNA。以第一链cDNAs为模板，应用CODE1和CODE2扩增出植酸酶基因的部分序列。分别针对每个克隆得到的序列设计两组嵌套引物，设计高(G+C)﹪含量的AD引物(arbitrary degenerate primer)，采用TAIL-PCR分别扩增出部分植酸酶基因的5’和3’端未知序列。对克隆得到的序列进行组装，获得了包含Aspergillus，niger 和Aspergillus oryzae 植酸酶全长基因以及部分5’UTR和3’UTR的序列。
设计引物扩增出 Aspergillus，niger、Aspergillus oryzae 植酸酶蛋白成熟肽编码区(不含信号肽序列)，在引物5’和3’端分别引入．EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ位点。将扩增得到的各真菌植酸酶成熟肽编码区连入表达载体pPIC9，获得重组表达质粒pPIC9-x，采用PEG1000介导的方法转化 Pichia pastoris GS115，筛选His<+>Mut<+>表型的重组酵母GS115-pPIC9-x。
重组酵母用甲醇诱导表达，对表达的产物进行了初步的性质分析。结果显示，A．niger rPhyA和A．oryzae rPhyA的最适温度均在55℃左右；在低于55℃时保温1.5min，A．niger rPhyA和A．oryzae rPhyA的残余酶活是未保温处理的样品活性的50﹪以上，超过55℃保温处理，酶活则急剧下降；A．niger rPhyA有两个最适pH，分别为2.5和5.5，其中pH2.5的活性是pn5.5活性的60﹪，A．oryzae rPhyA的最适pH则在6.0，当处于pH4.5-6.0的范围内时，这两种重组酶的活性为最大活性的60﹪以上。SDS-PAGE分析表明，A．niger rPhyA的表观分子量在70-90 kDa之间，而A．oryzae rPhyA则为70kDa左右，脱糖基化后，二者均为50kDa左右。序列分析和重组酶的性质表明，克隆的这两个真菌植酸酶基因均属于组氨酸酸性磷酸酶家族。