IGF-1C和P24多肽通过JNK/p38信号通路协同促进骨髓间充质干细胞成骨分化体外实验研究

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xinshou2010
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研究背景:外伤,肿瘤切除,感染或先天性畸形均可导致骨缺损。骨组织工程被认为是重建骨缺损的一个重要手段;生长因子是骨组织工程的重要要素之一。近年来,胰岛素生长因子1(Insulin-like growth factors-1,IGF-1)和骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)均被证明能促进骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成骨,且其成骨能力具有协同作用,但是其协同促进成骨的机制尚不清楚。生长因子存在价格昂贵,不易获得,容易失活等缺点,近期有研究报道IGF-1的C结构域IGF-1C和BMP-2的衍生肽P24,均具有生长因子相似的生物活性且原料易得、副作用少,这两种多肽能否协同促进BMSCs成骨,其机制是什么?尚未见报道。本研究将探究这两种多肽的成骨效应及机制,为多肽应用于组织工程学修复骨缺损提供研究基础。研究目的:本研究旨在探讨IGF-1C和P24多肽对SD大鼠BMSCs成骨分化的影响及其机制。研究方法:1.为确定IGF-1C和P24多肽体外促进BMSCs增殖及成骨分化的最佳浓度,将BMSCs分别与不同浓度的IGF-1C和P24多肽体外培养,通过cck-8(cell counting kit-8,cck-8)检测 BMSCs 的增殖及通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测BMSCs的分化。2.为研究IGF-1C和P24多肽单独及联合培养对BMSCs增殖及成骨分化的影响,将两种多肽单独和联合与BMSCs体外培养,通过cck-8和流式细胞仪检测细胞周期确定其对增殖的影响;采用ALP染色及活性检测,茜素红(Alizarin red S staining,ARS)染色及半定量检测其对BMSCs的成骨分化的作用;实时定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和免疫印迹法(Western Blot,WB)检测两种多肽单独及联合培养对BMSCs成骨分化相关基因和蛋白的影响。3.为探究IGF-1C和P24多肽协同促进BMSCs成骨分化的机制,将两种多肽单独和联合与BMSCs体外培养,通过Westen Blot检测p-JNK和p-p38的水平。并将联合培养组中添加JNK的化学抑制剂SP600125及p38的化学抑制剂SB203580,通过Westen Blot检测p-JNK和p-p38的表达水平及对RUNX2的蛋白表达水平的影响,通过ALP染色检测ALP的活性及ARS染色检测钙化结节形成的情况。研究结果:1.IGF-1C和P24多肽在体外单独培养BMSCs时,在本研究的浓度范围内促进增殖及成骨分化的最佳浓度均为50μg/mL。2.IGF-1C和P24多肽具有协同促进BMSCs的增殖,促进ALP活性及钙化结节形成的作用,并且上调Runx2、OCN和OSX基因及蛋白的表达。3.IGF-1C和P24多肽能协同激活JNK和p38信号通路,上调p-JNK,p-p38的表达水平;加入SP600125或SB203580后能抑制p-JNK或p-p38的表达水平,并阻断Runx2表达和抑制ALP的活性及钙化结节的形成。研究结论:IGF-1C和P24多肽能协同激活BMSCs的JNK和p38信号通路,增加ALP活性,上调Runx2、OCN和OSX基因及蛋白表达及促进钙化结节的形成,从而诱导新骨的形成。
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