海洋作为地球上最重要的生态系统之一,蕴含了大量的生物资源。由于海洋特有的环境因素,海洋微生物进化出了多样而且独特的生理机制来适应多变的海洋极端环境,具有多种催化活性的新型蛋白酶已经从可培养的海洋微生物中获得。很多海洋来源的活性蛋白酶已经制备成各类药用制剂用于伤口清创、血栓溶解和促进伤口愈合等方面。因此海洋微生物产的活性蛋白酶具有很大的医学应用潜力和价值。组织工程和再生医学主要是为了发展那些可为缺损组织和器官提供修复、再生或替代功能的生物基体或支架,以期建立可对损伤组织或器官进行形态和功能修复的方法。相比于人工合成材料和仿生生物材料,天然生物材料以其低毒性和高细胞相容性成为制备组织支架的首选材料。而以胶原蛋白为主的天然机体组织通过脱细胞处理后制备的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）支架,在生物化学组成和质地方面最大程度地接近天然状态,使得该材料被用作修复受损组织的有效替代物。目前主要通过化学、物理和酶解的方法进行组织脱细胞,酶解法因有毒物质残留低和对ECM损伤较小而被广泛应用。目前可用于组织脱细胞的酶较少,主要为胰蛋白酶、中性蛋白酶和核酸酶,但胰蛋白酶和中性蛋白酶对ECM中的胶原蛋白都有一定的破坏作用,而核酸酶很难将ECM中的免疫源性物质去除。因此,开发可应用于组织脱细胞的新型蛋白酶,对建立优良的ECM支架制备方法具有重要意义。组织再生过程需要在不同的细胞群体和组织器官之间传递大量的信息,生长因子在信息传递、促进细胞迁移、促进细胞分化、血管发生、刺激基质形成,并最终在受损组织重建中起着重要作用。如何将生长因子安全有效的负载在ECM支架上,制备具有更好修复效果的生长因子/ECM复合支架,是组织工程和研究热点。因此,设计并开发可使生长因子结合在ECM支架表面的结合系统,是提高以ECM为基础的支架性能的关键。本研究首先从海水和海洋沉积物样品中分离海洋细菌,获得微生物资源,为细菌及其蛋白酶的研究和开发奠定基础。菌株Myroides profundi D25和菌株Pseudoalteromonas sp.SM9913是本实验室从深海沉积物中分离获得的两株产蛋白酶细菌。前期研究表明,菌株D25分泌一种弹性蛋白酶myroilysin,对胶原蛋白没有降解活性,也不破坏胶原蛋白基本结构,但对胶原蛋白具有很强的膨胀作用。菌株SM9913分泌的胶原蛋白酶MCP-01中的C-端包含的多囊性肾病（Polycystic kidney disease,PKD）结构域对胶原蛋白有较强的吸附能力。本研究通过利用myroilysin膨胀胶原蛋白的性质制备以胶原蛋白为主要成分的ECM支架,利用PKD结构域结合胶原蛋白的性质,将PKD结构域与血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）和转化生长因子（Transforming growth factor,TGF）融合,制备可吸附胶原蛋白的融合蛋白PKD-VEGF和PKD-TGF,并用于制备负载生长因子的ECM复合支架。通过对支架进行全面的理化性质、生物学性质和动物模型检测,探索其在临床应用中的潜力。1.海洋细菌资源的筛选和多相分类学鉴定对采集自南北极的海水和海洋沉积物样品进行可培养细菌的筛选,筛选得到属于73个细菌种的142个菌株,其中疑似新菌种6株。通过多相分类学研究对筛选得到三株海洋来源的产蛋白酶细菌菌株SM1211T、SM1212T和SM1216T进行了鉴定。对菌株进行分子遗传学、形态学、生理生化和化学分类特征分析后,表明菌株SM1211T代表Rhodobacteraceae科内一个新属的新种,立新属并命名为Puniceibacterium antarcticum sp.nov.;菌株 SM1212T 代表 Flavobacteriaceae科内一个新属的新种,立新属并命名为Arcticiflavibacter luteus sp.nov.;菌株SM1216T为Algimona属中的新成员,命名为Algimonas arctica sp.nov.。新的产蛋白酶细菌菌株的获得,为为进一步研究和开发海洋细菌及其蛋白酶资源奠定了基础。2.利用海洋细菌蛋白酶myroilysin制备猪脱细胞真皮基质（Porcine acellular dermal matrix,PADM）及其性能研究前期研究表明,深海来源的细菌蛋白酶myroilysin对胶原蛋白没有降解活性,但对其有很强的膨胀作用。myroilysin通过降解胶原蛋白中起到交联和稳定结构作用的糖蛋白而导致胶原膨胀,膨胀之后,胶原蛋白氢键没有被破坏,三螺旋结构保存完整,胶原蛋白端肽也没有被剪切。根据myroilysin的这一特性,本研究用myroilysin对猪真皮组织进行脱细胞和膨胀处理,制备以胶原蛋白为主要成分的PADM。对用myroilysin制备的PADM与用SDS和胰蛋白酶制备的PADM进行了全面的物化性质评价和比较。结果表明,myroilysin制备的PADM具有更高的孔隙率、吸水率和体外降解率,并保持了一定的机械强度;与其他两种方法制备的PADM相比,免疫原性物质去除的更彻底,同时还存留了一部分生物活性细胞因子。并且,用myroilysin制备的PADM灭菌方便且彻底,低毒,具有良好的生物相容性。因此,采用myroilysin制备的PADM,满足了组织工程和再生医学中对组织支架制备的要求,可以作为基本ECM支架进行后续的优化和应用潜力评价。3.海洋细菌蛋白酶MCP-01中的C-端PKD结构域与生长因子融合蛋白的制备和功能检测及PKD结构域吸附胶原蛋白的结构基础前期研究表明,深海来源的蛋白酶MCP-01中的PKD结构域能吸附胶原蛋白,但不会破坏胶原蛋白三螺旋结构。本研究将PKD结构域与生长因子VEGF和TGF分别进行融合并在昆虫细胞sf9表达体系中进行异源表达并纯化,获得融合蛋白PKD-VEGF和PKD-TGF。对PKD-VEGF和PKD-TGF进行了蛋白稳定性、胶原吸附能力和细胞诱导活性检测。结果表明,融合表达的生长因子降解速率降低,PKD结构域在融合蛋白中可以行使吸附胶原蛋白的功能,吸附效果好,同时PKD-VEGF和PKD-TGF对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）具有诱导细胞增殖和分化的活性。因此,通过PKD结构域把VEGF和TGF有效连接到胶原蛋白上,是一种ECM支架负载生长因子的新方法。为了阐明PKD-VEGF和PKD-TGF吸附胶原蛋白的分子机制,本研究对PKD结构域进行了晶体培养和结构解析,通过分子对接（Molecule Docking）模拟了 PKD结构域与胶原分子结合的情况,并分析了 PKD结构域吸附胶原蛋白的分子机制。实验结果表明,PKD结构域由两个平行的β片层组成,每个β片层包含三个反向平行的β折叠,PKD结构域对胶原蛋白的吸附作用主要是通过两者间的静电相互作用完成的。通过PKD结构域对胶原蛋白的吸附作用,PKD-VEGF和PKD-TGF既可以稳定的暴露在支架内微环境中,又不会与支架结合过于牢固,使其维持在利于细胞生长分化的浓度水平。这些结果不仅揭示了 PKD与胶原蛋白的结合机制,也为生长因子在ECM支架上的有效负载提供了新思路。4.全皮层皮肤缺损动物模型的建立及负载生长因子的PADM复合支架临床应用潜力的研究为了探索负载有PKD-VEGF和PKD-TGF的复合支架的临床应用潜力,本研究首先对复合支架进行体外实验检测。体外检测表明,负载生长因子的复合支架具有良好的细胞相容性,为细胞生长提供了空间支持。为了研究该复合支架在动物体内的效果,本研究建立了大鼠背部全皮层皮肤缺损动物模型,将复合支架植入皮肤组织缺损部位。动物实验表明,填充复合支架对大鼠全皮层缺损的创口愈合有良好的促进作用。创口组织的组织学检测也表明复合支架可以加速创面新生组织的分化,促进血管生成,进而促进缺损组织修复、重构和再生。这些研究显示出该支架具有很好的临床应用前景。综上所述,本研究对海洋细菌资源进行了筛选和多相分类学鉴定,利用海洋细菌蛋白酶myroilysin制备了具有良好性能的组织支架PADM,利用海洋细菌蛋白酶MCP-01中的PKD结构域与生长因子融合制备了可吸附胶原蛋白的PKD-VEGF和PKD-TGF,从而制备了具有很好临床应用前景的负载生长因子的PADM复合支架。本研究表明海洋中蕴含着大量的微生物资源,海洋微生物产的活性蛋白酶具有很大的医学应用潜力和价值。