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背景：脊髓小脑型共济失调3型(SCA3/MJD)是遗传性脊髓小脑型共济失调最常见亚型。其发病是由于致病基因MJD1编码区内3’端的CAG重复序列异常扩增导致其编码产物ataxin-3蛋白的羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)肽链异常扩增引起。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)是新近发现的一类重要的蛋白质翻译后修饰因子。SUMO家族成员包括SUMO1、 SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4等至少四个家族成员,和泛素化类似,SUMOylation酶联反应需要SENP(Sentrin-specific proteases)、E1酶(SAE1/SAE2)、E2酶(Ubc9)、E3酶的参与。目前研究发现SUMO-1存在于帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、多系统萎缩、多聚谷氨酰胺疾病等多种神经退行性疾病的聚集体中。Smt3是SUMO在果蝇中的同源基因,lwr是Ubc9的同源基因。我们在前期研究中证实ataxin-3蛋白第166位赖氨酸(K166)为SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的关键氨基酸位点；进一步的体外实验证实阻断ataxin-3与SUMO-1的结合并不改变其亚细胞定位和经泛素化途径的降解,但影响了ataxin-3突变蛋白的稳定性及其细胞毒性,提示ataxin-3蛋白是SUMO-1的底物蛋白,苏素化修饰参与了SCA3/MJD的发病过程,但上述结果尚未得到体内实验的证实。目的：本研究拟利用转基因果蝇模型,进一步在体内实验中探讨SUMOylation对野生型和突变型SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响；并对其可能的机制进行初步探讨。方法：1.去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及可能机制1)利用基因重组技术、定点突变技术构建pUAST-attB-SCA3-Q27、 pUAST-attB-SCA3-Q27-K166R、pUAST-attB-SCA3-Q84和pUAST-attB-SCA3-Q84-K166R转基因果蝇质粒；应用转基因果蝇定点插入技术,以white标记进行基因筛选,得到野生型、polyQ扩展突变型和相应苏素位点突变的SCA3/MJD转基因果蝇品系。2)在果蝇复眼或神经系统中启动MJD1基因的表达,研究ataxin-3去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响,包括复眼结构、孵化率、雌雄比例、寿命、翅膀异常比例、爬行速度等的影响。3)应用Western blot技术检测去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型中ataxin-3水平及Smt3水平的影响。2.下调SUMOylation通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及可能机制1)应用Western blot技术检测SCA3/MJD转基因果蝇模型中Smt3水平的差异。2)利用果蝇染色体双平衡体系构建分别在复眼和神经系统中表达SCA3.fl-Q78的果蝇和在此基础上同时干扰Smt3的表达或表达具有显性负性效应的1wr蛋白的果蝇。3)下调SUMOylation通路后,对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响,包括复眼结构、孵化率、雌雄比例、寿命、翅膀异常比例、爬行速度等的影响。4)应用Western blot技术检测下调SUMOylation通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型中ataxin-3水平的影响。结果：1.去苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及可能机制1)构建了UAS-SCA3-Q27、 UAS-SCA3-Q27-K166R, UAS-SCA3-Q84和UAS-SCA3-Q84-K166R四种SCA3/MJD转基因果蝇模型。2)在复眼中表达SCA3-Q27、SCA3-Q27-K166R、SCA3-Q84和SCA3-Q84-K166R后,果蝇复眼外形未见明显异常。在神经系统表达SCA3-Q27或SCA3-Q27-K166R后,其孵化率、雌雄比例、寿命、翅膀、爬行速度与正常对照无差异；在神经系统表达SCA3-Q84、SCA3-Q84-K166R后,和野生型果蝇比较,其孵化率降低、雌雄比例增大、寿命缩短、部分翅膀发育异常、爬行速度减慢,而在神经系统表达SCA3-Q84-K166R比SCA3-Q84孵化率更低、雌雄比例更大、寿命更短、翅膀发育异常比例更高、爬行速度更慢,其差异具有统计学意义(P<0.05)。3)神经系统表达SCA3-Q27、SCA3-Q27-K166R,ataxin-3均呈SDS可溶性状态,其ataxin-3水平无明显差异,且无聚集体形成,其苏素化水平与正常对照相比无明显差异；表达SCA3-Q84、 SCA3-Q84-K166R后,ataxin-3可形成SDS不可溶性聚集体,且后者SDS不可溶性ataxin-3水平更高,其苏素化水平降低,提示SCA3-Q84去苏素化修饰后,稳定性更强,更易形成聚集体。2.下调SUMOylation通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型表型的影响及其可能机制1)在神经系统表达SCA3.fl-Q27或SCA3.fl-Q78,elav-GAL4/+; UAS-SCA3.fl-Q27/+组与正常对照组比较,Smt3水平无明显差异,而elav-GAL4/+; UAS-SCA3.fl-Q78/+组,Smt3水平明显增高,主要和SDS不可溶性蛋白共存。2)在果蝇复眼中下调SUMOylation通路后,gmr-GAL4/+;UAS-SCA3.fl-Q78/+复眼表型加重,色素脱失更加明显；在神经系统中下调SUMOylation通路后,elav-GAL4/+; UAS-SCA3.fl-Q78/+果蝇寿命缩短,爬行速度减慢。3) Western blot检测显示,下调SUMOylation通路后,SDS不可溶性ataxin-3水平增高,提示其表型加重可能与ataxin-3聚集体水平增高相关。结论：1.K166位点突变后,扩展突变型SCA3/MJD转基因果蝇模型表型加重,孵化率降低、雌雄比例增大、寿命缩短、部分翅膀发育异常、爬行速度减慢,提示ataxin-3蛋白的苏素化修饰对SCA3/MJD转基因果蝇模型具有保护作用。2.K166位点突变后,扩展突变型ataxin-3毒性增强与去苏素化修饰后其稳定性增加,更易形成SDS不可溶性聚集体相关。3.扩展突变型SCA3/MJD转基因果蝇模型中,其Smt3水平增高,再次提示SUMOylation参与了对突变型ataxin-3毒性的调节。4.下调苏素化通路后,SCA3/MJD转基因果蝇模型复眼表型更重,寿命缩短,爬行速度减慢,提示苏素化通路对SCA3/MJD转基因果蝇模型具有保护作用。5.下调苏素化通路后,SCA3/MJD转基因果蝇模型表型加重与ataxin-3稳定性增加,更易形成SDS不可溶性聚集体相关。