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MicroRNAs(miRNAs)作为一类具有高度保守性的内源性非编码小RNA,广泛参与到包括免疫系统在内的生物体各个系统的活动中。文献报道miR-105b在炎症反应过程中具有重要的调控作用,但在家养动物中未见miR-105b与炎症反应的相关研究。奶牛乳房炎是由革兰氏阴性细菌等病原体感染乳腺上皮细胞引起的一种疾病,严重危害奶牛生产及其经济效益。为了探讨miR-105b在奶牛乳房炎症中是否有调控作用,本试验用大肠杆菌来源脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理牛乳腺上皮细胞,建立体外牛乳腺上皮细胞炎症模型。并在此基础上,利用qRT-PCR、过表达和抑制表达等技术验证miR-105b在炎症反应过程中的作用,为奶牛乳房炎的相关分子标记辅助选择提供理论依据。本试验结果如下:(1)用不同浓度LPS刺激牛乳腺上皮细胞后,通过CCK8试验发现LPS浓度为10μg/m L时细胞抑制率最接近10%。用10μg/m L的LPS刺激牛乳腺上皮细胞,处理不同时间后通过ELISA和qRT-PCR检测TNF-α细胞因子浓度和基因表达水平,结果发现LPS处理6 h时TNF-α的含量极显著增高。同时,Western blot检测发现TLR4、Myd88的蛋白水平显著升高(p<0.05),说明在牛乳腺上皮细胞中,10μg/m L LPS处理6 h可有效触发炎症因子的表达和分泌,且LPS是通过与TLR4结合,同时募集配体Myd88来介导炎症反应,细胞炎症模型构建成功。(2)采用qRT-PCR技术对miR-105b的表达水平进行检测,发现miR-105b在牛乳腺上皮细胞炎症模型中极显著高表达(p<0.01),表明miR-105b可能参与LPS诱导的乳腺上皮细胞炎症反应。(3)利用生物信息学对miR-105b的靶基因预测发现,AKT3与miR-105b具有一个保守的结合位点,表明AKT3是miR-105b的一个潜在靶基因。进一步利用双荧光素酶报告系统验证发现,miR-105b mimic和AKT3 3’UTR野生质粒共转染后,其荧光素酶活性降低显著低于miR-105b NC组,表明miR-105b可与AKT33’UTR靶向结合,抑制AKT3的活性。(4)miR-105b mimic转染效率研究发现,转染后miR-105b的表达水平极显著增高(p<0.01),约为对照组的800倍,表明转染成功。然后继续用LPS感染6 h,结果显示炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA水平均极显著降低(p<0.01),IL-10的mRNA表达量显著增高(p<0.05);AKT3和p-AKT3的蛋白水平显著降低(p<0.05)。(5)进一步转染miR-105b inhibitor,细胞内miR-105b的表达量显著下调(p<0.05)。LPS诱导6 h后,炎症因子TNF-α、IL-6的mRNA水平均极显著增高(p<0.01),IL-10的mRNA表达量无显著差异;AKT3和p-AKT3的蛋白水平显著增高(p<0.05)。综上所述,在LPS诱导的牛乳腺上皮细胞炎症反应中,miR-105b可通过靶向AKT3基因抑制TNF-α和IL-6 mRNA的表达,进而抑制炎症发生。