猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV），为单股正链RNA病毒，基因组长度约为12.3kb，编码12种病毒蛋白。微小RNA（miRNAs）是存在于多种生物细胞内的非编码单链RNA，长度大约为22个核苷酸（Nucleotide,nt），主要具有RNA剪切以及基因转录前调控等功能。MiRNAs主要通过靶标目的基因的3’非编码区(3’untranslated regions,3’UTR)起作用，当miRNAs的种子序列与靶标基因序列完全互补时降解靶基因，而当不完全互补时通过抑制靶基因翻译的方式发挥作用。我们对CSFV感染的猪脐静脉内皮细胞（Swine umbilical vein endothelial cells,SUVEC）通过基因组高通量测序，进行差异miRNAs筛选。发现在CSFV感染后SUVEC中有8个显著上调和4个下调显著的miRNAs，但这些miRNAs在CSFV感染中的作用尚缺少研究。通过软件预测发现，在CSFV和SUVEC中均存在miR-140调控的靶标基因，对SUVEC中受miR-140调控靶标基因的鉴定、miR-140靶标蛋白与CSFV编码的互作蛋白的鉴定以及其对CSFV复制的影响，将为CSFV的致病机理研究提供新的思路和新的科学资料。本研究主要取得以下结果：　　（1）感染CSFV的猪脐静脉内皮细胞中miR-140下调　　对SUVEC接种CSFV，用RT-qPCR检测miR-140，发现细胞中miR-140被极显著下调（p<0.001）。　　（2）miR-140可抑制CSFV在猪脐静脉内皮细胞中的复制　　将miR-140模拟物（mimics）和抑制剂(inhibitors)转染SUVEC后12h再接种CSFV，于接毒后24h、36h、48h和72h，应用RT-qPCR分别检测细胞中病毒基因转录量和细胞上清中病毒基因拷贝量。结果显示，在转染miR-140mimics的细胞中CSFV在核酸水平显著降低（p<0.05），呈现剂量相关性。转染miR-140inhibitors后细胞内和上清中病毒核酸量均显著高于对照组（p<0.05）。　　（3）猪血管内皮细胞中miR-140的靶基因是Rab25　　用双荧光素酶报告系统进行miR-140与Rab25基因的调控检测，结果显示，转染Rab25-3’UTR野生型重组质粒+miR-140mimics组细胞萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性极显著低于Rab25-3’UTR野生型重组质粒+miR-140NC（p<0.001）；而Rab25-3’UTR突变型重组质粒+miR-140mimics组细胞萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性与Rab25-3’UTR突变型重组质粒+miR-140mimics-NC无显著差异，说明Rab25-3’UTR是miR-140的靶基因。将miR-140mimics及inhibitors分别转染SUVEC，转染后24h，分别应用RT-qPCR和Western blot检测Rab25核酸和蛋白发现，miR-140能显著下调Rab25的表达（p<0.001），下调miR-140后，Rab25表达被显著上调（p<0.05）。　　（4）Rab25蛋白促进CSFV复制　　分别构建表达Rab25的重组质粒（CMV-Rab25）和干扰其表达的重组质粒，将CMV-Rab25转染SUVEC24h后，接种CSFV，分别在接毒后24h、48h用RT-qPCR检测细胞CSFV的核酸量。发现CSFV核酸量上调，但在24h与对照组差异不显著，在48h差异显著（p<0.001）。筛选获得重组干扰质粒shRab25-2，转染SUVEC后24h接种CSFV，接毒后24h和48h，应用RT-qPCR检测细胞CSFV的核酸量。结果表明，接毒后24h试验组与对照组无显著差异，48h试验组细胞中的CSFV核酸量显著低于对照组（p<0.001）。　　（5）Rab25蛋白与CSFV NS5A蛋白存在细胞共定位，NS5A的804-1491位为可能的关键作用位点　　将重组质粒pDsRed1-N1-Rab25分别与pcDNA3.1(+)-NS2、pcDNA3.1(+)-NS3和pcDNA3.1(+)-NS5A重组表达质粒共转染于SUVEC。通过共聚焦扫描显微镜发现，Rab25与NS5A存在明显的共定位。将pEGFP-C1-NS5A-1-84、pEGFP-C1-NS5A-84-804和pEGFP-C1-NS5A-804-1491分别与pDsRed1-N1-Rab25共转染SUVEC，通过共聚焦扫描显微镜观察到NS5A的804-1491基因区段表达产物与Rab25存在明显的共定位。　　本研究表明，猪脐静脉内皮细胞的miR-140在细胞内的靶基因是Rab25，其与猪瘟病毒NS5A蛋白存在共定位，Rab25蛋白对猪瘟病毒的复制具有促进作用。