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猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),为单股正链RNA病毒,基因组长度约为12.3kb,编码12种病毒蛋白。微小RNA(miRNAs)是存在于多种生物细胞内的非编码单链RNA,长度大约为22个核苷酸(Nucleotide,nt),主要具有RNA剪切以及基因转录前调控等功能。MiRNAs主要通过靶标目的基因的3’非编码区(3’untranslated regions,3’UTR)起作用,当miRNAs的种子序列与靶标基因序列完全互补时降解靶基因,而当不完全互补时通过抑制靶基因翻译的方式发挥作用。我们对CSFV感染的猪脐静脉内皮细胞(Swine umbilical vein endothelial cells,SUVEC)通过基因组高通量测序,进行差异miRNAs筛选。发现在CSFV感染后SUVEC中有8个显著上调和4个下调显著的miRNAs,但这些miRNAs在CSFV感染中的作用尚缺少研究。通过软件预测发现,在CSFV和SUVEC中均存在miR-140调控的靶标基因,对SUVEC中受miR-140调控靶标基因的鉴定、miR-140靶标蛋白与CSFV编码的互作蛋白的鉴定以及其对CSFV复制的影响,将为CSFV的致病机理研究提供新的思路和新的科学资料。本研究主要取得以下结果: (1)感染CSFV的猪脐静脉内皮细胞中miR-140下调 对SUVEC接种CSFV,用RT-qPCR检测miR-140,发现细胞中miR-140被极显著下调(p<0.001)。 (2)miR-140可抑制CSFV在猪脐静脉内皮细胞中的复制 将miR-140模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)转染SUVEC后12h再接种CSFV,于接毒后24h、36h、48h和72h,应用RT-qPCR分别检测细胞中病毒基因转录量和细胞上清中病毒基因拷贝量。结果显示,在转染miR-140mimics的细胞中CSFV在核酸水平显著降低(p<0.05),呈现剂量相关性。转染miR-140inhibitors后细胞内和上清中病毒核酸量均显著高于对照组(p<0.05)。 (3)猪血管内皮细胞中miR-140的靶基因是Rab25 用双荧光素酶报告系统进行miR-140与Rab25基因的调控检测,结果显示,转染Rab25-3’UTR野生型重组质粒+miR-140mimics组细胞萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性极显著低于Rab25-3’UTR野生型重组质粒+miR-140NC(p<0.001);而Rab25-3’UTR突变型重组质粒+miR-140mimics组细胞萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性与Rab25-3’UTR突变型重组质粒+miR-140mimics-NC无显著差异,说明Rab25-3’UTR是miR-140的靶基因。将miR-140mimics及inhibitors分别转染SUVEC,转染后24h,分别应用RT-qPCR和Western blot检测Rab25核酸和蛋白发现,miR-140能显著下调Rab25的表达(p<0.001),下调miR-140后,Rab25表达被显著上调(p<0.05)。 (4)Rab25蛋白促进CSFV复制 分别构建表达Rab25的重组质粒(CMV-Rab25)和干扰其表达的重组质粒,将CMV-Rab25转染SUVEC24h后,接种CSFV,分别在接毒后24h、48h用RT-qPCR检测细胞CSFV的核酸量。发现CSFV核酸量上调,但在24h与对照组差异不显著,在48h差异显著(p<0.001)。筛选获得重组干扰质粒shRab25-2,转染SUVEC后24h接种CSFV,接毒后24h和48h,应用RT-qPCR检测细胞CSFV的核酸量。结果表明,接毒后24h试验组与对照组无显著差异,48h试验组细胞中的CSFV核酸量显著低于对照组(p<0.001)。 (5)Rab25蛋白与CSFV NS5A蛋白存在细胞共定位,NS5A的804-1491位为可能的关键作用位点 将重组质粒pDsRed1-N1-Rab25分别与pcDNA3.1(+)-NS2、pcDNA3.1(+)-NS3和pcDNA3.1(+)-NS5A重组表达质粒共转染于SUVEC。通过共聚焦扫描显微镜发现,Rab25与NS5A存在明显的共定位。将pEGFP-C1-NS5A-1-84、pEGFP-C1-NS5A-84-804和pEGFP-C1-NS5A-804-1491分别与pDsRed1-N1-Rab25共转染SUVEC,通过共聚焦扫描显微镜观察到NS5A的804-1491基因区段表达产物与Rab25存在明显的共定位。 本研究表明,猪脐静脉内皮细胞的miR-140在细胞内的靶基因是Rab25,其与猪瘟病毒NS5A蛋白存在共定位,Rab25蛋白对猪瘟病毒的复制具有促进作用。