研究背景2型糖尿病(T2DM)是由于胰岛素分泌或者作用缺陷,以高血糖为主要表现的一种复杂代谢性疾病。近十年来,全球糖尿病患病率急剧升高。最近的全国流行病学调查数据显示,我国成人糖尿病患病率高达11.6%,糖尿病已成为我国主要的公共卫生问题之一。与其他常见的疾病一样,2型糖尿病具有很强的遗传易感性,遗传因素在2型糖尿病的发生及表现中起着重要作用。现代的孪生子研究表明,2型糖尿病的遗传力高达64%。近年来学者们在糖尿病遗传领域开展了大量的研究,但2型糖尿病致病基因的研究仍进展缓慢。虽然最近的全基因组关联研究已经报道了一些糖尿病风险基因和位点,但是2型糖尿病具体的遗传机制仍尚不明确。护骨素(OPG)、核因子κ.B受体活化因子(RANK)及其配体(RANKL)是RANKL/RANK/OPG信号通路的三个主要蛋白,分别由TNFRSF11B、TNFRSF11A和TNFSF11基因编码。RANKL/RANK/OPG信号通路是骨代谢的关键通路,在调节骨代谢、破骨细胞的生存和活化等方面起着重要作用。正常生理情况下RANKL通过与其受体RNAK结合,刺激破骨细胞活化和骨吸收,而OPG通过竞争性抑制RANKL与RANK的结合,从而抑制骨吸收。除参与骨代谢外,RANKL/RANK/OPG信号通路也参与细胞增殖和凋亡、血管钙化、动脉粥样硬化、肿瘤骨转移、炎症和免疫等多种病理生理过程。最近研究报道,RANKL/RANK/OPG通路也可能在2型糖尿病的发病中起着重要作用,通过阻断该通路可以改善胰岛素抵抗和防止2型糖尿病的发生。也有研究发现OPG在胰腺表达,并可能具有保护胰岛p细胞的作用。鉴于RANKL/RANK/OPG信号通路在骨代谢中的重要作用,国外有不少研究报道RANKL/RANK/OPG信号通路基因多态性与骨密度密切相关,我们前期的研究也发现RANKL/RANK/OPG系统的基因多态性与中国汉族女性骨密度相关。由于RANKL/RANK/OPG通路可能也参与了糖尿病的发生发展,但编码RNKL/RANK/OPG系统的三个基因TNFSF11、 TNFRSF11A、和TNFRSF11B的单核苷酸多态性(SNP)是否与糖尿病相关,目前尚少见相关的研究报道。RANKL/RANK/OPG信号通路中的OPG是一种分泌性糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族。研究报道2型糖尿病患者血清OPG水平明显升高,并且OPG是糖尿病微血管并发症的独立危险因素。OPG可能是糖尿病的一种有效的早期生物标志物。基于此,我们开展本研究观察糖尿病及糖尿病前期患者血清OPG水平的变化,分析其相关的影响因素,并探讨中国汉族女性RANKL/RANK/OPG系统基因多态性与2型糖尿病的相关性。第一章RNNKL/RANK/OPG系统基因多态性与2型糖尿病的关联研究研究目的通过病例对照研究分析中国汉族女性RANKL/RANK/OPG系统三个基因TNFSF11、TNFRSF11A和TNFRSF11B的21个标签SNP位点与2型糖尿病的关联性,探讨RANKL/RANK/OPG系统参与2型糖尿病发病的可能遗传机制。研究方法1.本病例对照研究自2013年1月至2013年12月在南昌市第三医院共招募研究对象1233例。所有研究对象均为江西南昌地区居住5年以上,彼此间无亲缘关系的绝经后汉族妇女,其中对照组患者719例正常健康人群来自课题组前期的绝经后女性骨质疏松研究,病例组514例2型糖尿病患者为南昌市第三医院内分泌代谢科住院患者。所有研究对象均填写知情同意书。2.采用自制的调查问卷进行登记。调查内容包括调查内容包括一般情况、年龄、经济收入、教育程度、工作情况、吸烟史、饮酒史、体育锻炼、月经初潮、闭经时间、婚育史、既往病史及家族史等。3.测量身高、体重、腰围、臀围,读数分别精确至0.5 kg和0.5 cm。采用公式体重(kg)／身高2(m)计算体重指数,腰围(cm)/臀围(cm)计算腰臀比。4.采用欧姆龙简易体脂测量仪(HBF-375)测量体脂含量检测进行检测,欧姆龙(HEM-7200)电子血压计检测血压及脉率。5.所有研究对象均抽血检测肝功能(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶)、肾功能(尿素氮、血肌酐)、血脂(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)、血糖(空腹血糖、餐后2小时血糖)、血尿酸等指标。所有检测均当日进行,采用西门子公司的ADVIA2400全自动生化分析仪检测,糖化血红蛋白检测采用高效液相色谱法(美国Bio-Rad公司),胰岛素检测采用化学发光法(德国西门子公司)6.选取RANKL/RANK/OPG系统三个基因TNFSF11、TNFRSF11A和TNFRSF11B的共21个标签SNP位点,其中TNFSF11基因6个(rs9525641、 rs2277439、rs2324851、rs2875459、rs2200287、rs9533166), TNFRSF11A基因9个(rs9962159、rs4603673、rs7239261、rs4500848、rs6567270、rs1805034、 rs4303637、rs4941131、rs9646629),TNFRSF11B基因6个(rs1485286、rs11573869、 rs3102728、rs11573819、 rs2073618、rs2073617)。采用上海天昊生物信息公司开发的多重高温连接酶检测反应技术(improved multiple ligase detection reactio, iMLDR)进行21个标签SNP位点的分型检测。7.采用SPSS 19.0软件对数据进行统计处理,计量资料以均数±标准差表示,对照组与病例组连续性变量比较采用两独立样本的t检验,计数资料的比较采用卡方检验。以基因计数法计算基因频率及等位基因频率,基因型频率分布的Hardy-Weinberg平衡卡方检验,以P>0.05表示为符合Hardy-Weinberg平衡。使用Haploview 4.2及PLINK软件用分析单倍型和连锁不平衡。标签SNP与2型糖尿病的相关性采用逐步Logistic回归模型分析,同时校正体重、年龄及生活方式等可能混杂因素,以OR值及95%可信区间来表示相关联程度,P<0.05表示为差异有统计学意义。研究结果1.病例组与对照组年龄无明显差异(t=1.624,P=0.105)。2型糖尿病组中一些可能与糖尿病相关的指标明显高于对照组,如空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白、体重、体重指数等(P均<0.05)。此外,2型糖尿病组的甘油三酯、低密度脂蛋白、谷丙转氨酶水平也明显高于对照组(P均<0.05),但高密度脂蛋白水平低于对照组(t=13.641,P<0.001)。2.通过温伯格平衡定律检验发现,TNFSF11基因的1个SNP rs9533166不符合哈温伯格平衡(P=0.020),该SNP不列入下一步相关性分析,其余20个SNP均符合哈温伯格平衡(均P>0.05)。3. TNFRSF11B基因的2个SNP位点rs11573819和rs2073618等位基因频率在病例组及对照组中分布有差异。rs11573819位点等位基因A (OR=0.83 95%CI=0.69-0.99, P=0.026)和rs2073618位点等位基因C (OR=0.78 95%Cl=0.63-0.97,P=0.043)均可能降低2型糖尿病风险。进一步对标签SNP位点基因型频率进行分析发现,TNFRSF11B基因的4个SNP位点rs1485286、 rs11573819、rs2073618和s2073617基因型在病例组及对照组中分布有差异(P值分别为0.003,0.006,0.001和0.014)。4.以糖尿病为应变量,所有SNP位点为自变量进行多因素逐步Logistic回归分析,并校正年龄、体重指数、吸烟、饮酒和运动等混杂因素后,研究结果发现只有TNFRSF11B基因的1个SNP位点rs11573819与糖尿病相关(OR=0.78, 95%CI=0.62-0.98, P=0.036)。5.在位点rs11573819,A等位基因频率在病例组为14.9%,对照组为18.3%,而G等位基因在病例组为85.1%,对照组为81.7%,在校正年龄、体重指数及生活方式等因素后,等位基因A可以降低2型糖尿病风险(OR=0.78,95%CI=0.62-0.98,P=0.036)。在该位点中,糖尿病组GG、GA、AA基因型频率分别为73.3%、23.6%、3.1%,而对照组分别为65.8%、31.8%和2.4%。相对于GG基因型,GA基因型携带者可以降低糖尿病风险(OR=0.66,95%CI=0.50-0.87,P=0.003)。6.本研究通过Haploview软件生成连锁不平衡模块,再采用PLINK软件候选基因进行单倍体分析。在所有20个SNP中,共发现4个连锁不平衡模块。进一步进行2型糖尿病关联单倍体分析发现TNFRSF11B基因rs1485286-rs11573869-rs3102728-rs11573819-rs2073618模块的2个单倍体(TATGG和CATAC)与2型糖尿病相关,其中TATGG单倍体携带者可增加糖尿病风险(OR=1.21, 95%CI=1.01-1.46,P=0.042),而CATAC单倍体携带者可以降低糖尿病风险(OR=0.79,95%CI=0.64-0.99,P=0.037)。研究结论RANKL/RANK/OPG系统TNFRSF11B基因的1个SNP位点rs11573819的多态性与中国汉族女性2型糖尿病遗传易感性相关。第二章血清OPG水平在不同糖调节状态人群中的差异及相关因素分析研究目的观察绝经后女性2型糖尿病及糖尿病前期患者血清0PG水平变化,分析其相关影响因素,探讨血清0PG水平与胰岛素抵抗的相关性。研究方法1.所有271例研究对象均来自2013年1月至2013年12月南昌市第三医院进行绝经后女性骨质疏松研究的人群。根据不同的糖耐量水平分为2型糖尿病组93例,糖调节受损组(又称为糖尿病前期)90例,正常糖调节组88例。所有研究对象均为绝经后汉族妇女,填写知情同意书。2.测量身高、体重、腰围、臀围,读数分别精确至0.5 kg和0.5 cm。采用公式体重(kg)/身高2(m)计算体重指数,腰围(cm)/臀围(cm)计算腰臀比。3采用欧姆龙简易体脂测量仪(HBF-375)测量体脂含量检测进行检测,欧姆龙(HEM-7200)电子血压计检测血压及脉率。4.所有研究对象均抽血检测肝功能(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶)、肾功能(尿素氮、血肌酐)、血脂(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)、血糖(空腹血糖、餐后2小时血糖)、血尿酸等指标。所有检测均当日进行,采用西门子公司的ADVIA2400全自动生化分析仪检测,糖化血红蛋白检测采用高效液相色谱法(美国Bio-Rad公司),血清OPG水平采用酶联免疫法进行(美国RayBiotech公司),胰岛素检测采用化学发光法(德国西门子公司)。胰岛素抵抗采用胰岛素抵抗指数稳态模型评估(Homeostasis model of assessment for insulin resistence index, HOMA-IR),采用公式[空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mU/mL)/22.5]计算HOMA-IR。5.采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,数据资料以均数±标准差或者中位数(第25-75百分位数)表示。数据正态性分布采用Kolmogorov-Smirnov检验,对于正态性分布的数据采用单因素方差分析(ANOVA)比较组间连续变量,两两比较采用LSD-t检验。计数资料比较采用卡方检验。对于非正态分布的数据,采用Kruskal-Wallis非参数检测比较组间差异。血清OPG水平与其他指标的两变量相关性采用Spearman相关系数表示。采用多因素逐步线性回归分析相关指标对血清OPG水平的影响,以P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.三组人群在年龄、体重指数、收缩压、脉率、身高、体脂含量、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐和低密度脂蛋白等方面无组间差异(均P>0.05)。正常糖调节组人群血清OPG浓度为(151.00±45.72) pg/ml,低于糖尿病前期人群的(169.28 ±64.91) pg/ml和糖尿病组的(183.20±56.53) pg/ml,差异有统计学意义(P=0.031和P<0.001)。虽然糖尿病前期人群血清OPG水平低于2型糖尿病组,但差异无统计学意义(P=0.096)。在不同模型下校正年龄、体重指数等相关影响因素后,糖尿病组及糖调节受损组的血清OPG水平仍高于对照组。糖尿病及糖尿病前期组的腰臀比、谷丙转氨酶、血尿酸、甘油三酯、空腹血糖、餐后2小时血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白及HOMA-IR明显高于对照的正常糖调节组(均P<0.05)。2.血清OPG水平与HOMA-IR呈明显正相关(r=0.134,P=-0.027)。此外,血清OPG水平还与年龄(r=0.453,P<0.001)、腰臀比(r=0.125,P=0.039)、体脂含量(r==0.213,P<0.001)、碱性磷酸酶(r=0.175,P=0.004)、血肌酐(r=0.193,P=0.001)、餐后2小时血糖(r=0.270,P<0.001)、糖化血红蛋白(r=0.214,P<0.001)等成正相关。3.以血清OPG水平为应变量,将年龄、体脂含量、腰臀比、体重指数、收缩压、舒张压、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、血肌酐、血尿酸、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白和HOMA-IR纳入模型进行分析。通过逐步线性回归分析,结果发现进入方程的为HOMR-IR (P=0.019)、年龄(P<0.001)、餐后2小时血糖(P=0.002)、谷草转氨酶(P<0.001)、碱性磷酸酶(P=0.003)、血肌酐(P<0.001)和血尿酸(P=0.006),提示这些指标可能与OPG水平相关。研究结论1.绝经后女性2型糖尿病及糖尿病前期患者血清OPG水平高于正常对照人群。2.绝经后女性血清OPG水平与胰岛素抵抗水平呈正相关。3.血清OPG水平可能是2型糖尿病患者一个有效的早期分子标记物。