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马铃薯是世界性高产作物，我国种植面积和产量都居世界第一位。马铃薯病毒病是马铃薯生产中的重要制约因素，大规模组织培养无病毒种薯生产是控制马铃薯病毒病的主要方法，而优良种薯生产要求建立快速，准确，灵敏的病毒检测方法。本研究的主要目的是开发适合于同步检测多种马铃薯病毒的多重反转录聚合酶链式反应（M-RT-PCR）检测体系，为研制马铃薯病害多靶标、固相化检测试剂盒，提供技术保障和测试手段。 1．RT-PCR反应引物的设计：根据已知马铃薯病毒外壳蛋白区序列设计马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）及马铃薯S病毒（PVS）特异性引物对；根据P1基因区序列设计马铃薯A病毒（PVA）特异性引物对；根据全基因组序列设计马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）特异性引物对。采用一步法和两步法RT-PCR对5种病毒和类病毒进行了同步扩增，扩增片段大小为562bp（PVX）、480bp（PVY）、336bp（PLRV）、255bp（PVA）、182bp（PVS）、360bp（PSTVd）。 2．简易快速的样品制备技术的建立：配制的以0.5％TritonX-100 R和0.4％Na2SO3为主要成分的马铃薯病毒RNA浸提液，可以从叶片、叶梗、茎干、马铃薯薯块中快速释放马铃薯病毒RNA。浸提法提取马铃薯病毒RNA快速简单，只需将叶片（5mg～10mg），叶梗或茎干（20mg～30mg），马铃薯块（30mg～40mg）加入100μl病毒浸提液中于37℃恒温水浴20min，离心后将上清液直接用来进行RT-PCR反应。测试表明，病毒ssRNA上清液于-20℃至少可以保存3个月，可用于单重，多重RT-PCR反应。简易浸提法操作简单、快捷有效，样品完全适合反转录合成cDNA，以供PCR扩增。 3．两步法RT-PCR检测体系优化：优化了两步法单重，二重和多重RT-PCR反应，利用优化的多重RT-PCR反应体系可以同步检测马铃薯多种病毒。优化的单重RT-PCR反应中，反转录反应总体积为10μl/管，需2.5U RNA酶抑制剂（Promega），25U MMLV反转录酶（MMLV RT,Promega），dNTPs 0.5mmol/L，42℃反转录30min。PCR反应总体积为25μl，0.2mmol/LdNTPs，1U重组Taq酶（Promega），2.5mmol/L MgCl2，PCR反应条件是94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，末次延伸72℃ 10min。二重RT-PCR反转录反应中dNTPs 1.0 mmol/L，其他试剂浓度与单重RT-PCR相同。多重RT-PCR反转录反应中dNTPs增加至1.5 mmol/L，RNA酶抑制剂增加至10U，反转录酶增加至100U。多重RT-PCR聚合酶链式反应中dNTPs增加至0.5mmol/L，2U重组Taq酶，3.5mmol/L MgCl2。反转录反应程序中42℃反转录45min，PCR反应程序中72℃延伸1min，其它条件与单重RT-PCR反应相同。 4．双酶一步法检测试剂配方优化：试验中配制了适用于反转录和PCR反应的一步法RT-PCR反应缓沖液，优化了一步法反应条件，利用优化的反应条件可以同步检测马铃薯多种病毒。优化的一步法单重RT-PCR反应中加入1.5mmol/L MgCl2，5URNA酶抑制剂，50U MMLV 西南农业大学硕士学位论文反转录酶，lu重组Taq酶，0.50呱dNT?s，病毒下游引物0.5 pm。比。二重加入2.SInln。呱MgCb，1乃mmol凡dNT?s;多重RrpCR反应中加入3.5。UL MgC12，10U RNA酶抑制剂，100U MMLV反转录酶，1.smmo呱dNT卫s。单重和二重反应条件为25℃10min，42℃301llin，95 oC Zmin;94oC 305，6（）oC 305，72oC 305，共30个循环，最后 72oC 10 min。多重反应条件为25oC 10 min，42oC 45 min，95oC Zmin;94oC 305，60oC 305，72℃lmin，共30个循环，最后72oC 10 mino 5.扩增产物的准确性验证:切胶回收PVY、PVX、PVA、PVS、PLRVR不PCR扩增产物，分别克隆到pMD18一T载体中，通过PCR验证得到的阳性克隆（白色菌落）分别含有以上5种病毒的靶序列cDNA;提取质粒测序，经用NCBI Bl浏气ST比对，结果表明扩增的5种马铃薯病毒靶带的序列与己知基因的靶序列完全一致，表明Rl’- PCR扩增产物准确无误。 ‘.F汪下PCR检测性能测定:采用马铃薯5种病毒的引物对经Rl’- PCR扩增天竺葵皱缩花叶病毒，南瓜花叶病毒，番茄花叶病毒，蜀葵花叶病毒的RNA，不产生任何DNA条带，而阳性对照有特异性靶带，阴性对照无任何DNA条带产生。紫外分光光度计测定蛋白酶K法提取的Pvx病毒总RNA含量为56.04n纳l，稀释104倍后仍能检测到靶带。将浸提法提取的病毒总RNA稀释32倍以后也能扩增出靶带。以不同的PCR仪及不同的扩增方式对样品进行扩增，结果表明都能扩增出靶带，扩增结果差别不明显。 7.固相化检测试剂盒研制与应用:基于马铃薯病毒病Rl:PCR优化的试剂配方，加入专有的生物活性分子稳定剂制成的固相化预混试剂，经真空冷冻干燥后制成固相化检测试剂盒，可以在常温条件下密封保存，每月以靶病毒测定扩增效果。检测结果表明，试剂盒在常温下至少可以保存6个月，检测稳定性、灵敏度和特异性等各项指标均无明显改变。运用分子检测试剂盒对温室接种的几种马铃薯病毒进行检测，结果显示接种的病毒都能检测出来。采集田间具皱缩花叶症状的样品，检测结果样品都带有病毒。采用多重Rl:PCR检测试剂盒，对来自四川、重庆等15县市248个田间与