熊果酸对腺样囊性癌-83增殖抑制和诱导凋亡的观察

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目的熊果酸(ursolic acid,UA)是从天然植物中提取的五环三萜类化合物,近年来研究证实熊果酸具有明显的抗肿瘤活性,但具体机制目前仍不明确,有关于熊果酸抗腺样囊性癌的报道罕见。通过熊果酸作用于腺样囊性癌-83(ACC-83),观察熊果酸对ACC-83细胞增殖抑制、诱导凋亡的作用,研究熊果酸在增殖抑制、诱导凋亡过程中对COX-2、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达的影响,分析其诱导凋亡的可能机制,为进一步应用于临床奠定基础。方法(1)采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测熊果酸5个不同浓度组干预ACC-83细胞24、48和72h后细胞的光吸收值(OD),绘制增殖抑制曲线。(2)碘化丙啶(PI)单染流式细胞术进行熊果酸3个不同浓度组作用ACC-83细胞的周期分析,观察不同浓度熊果酸干预24h后各组G0/G1期、S期及G2/M期的细胞百分比分布;利用Annexin V-FITC、PI双标记细胞凋亡检测法检测熊果酸3个不同浓度组干预ACC-83细胞24h后对细胞凋亡的影响。(3)采用瑞氏-吉姆萨染色法,光学显微镜下观察细胞形态学变化。(4)采用Western blot技术检测COX-2、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达情况。结果(1)熊果酸以时间、剂量依赖性方式抑制ACC-83细胞增殖,24 h、48h和72h抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)分别为(57.14±6.62)μmol/L、(16.57±4.68)μmol/L及(7.29±4.26)μmol/L。(2)熊果酸3个不同浓度组(25、50和100μmol/L)作用于ACC-83细胞24h后,与同期正常对照组比较,S期细胞比例均明显增高,差异具有统计学意义(均P﹤0.05),并且随熊果酸浓度升高,G0/G1期细胞的比例逐渐降低,G2/M期细胞无明显变化,细胞周期阻滞于S期。熊果酸能诱导ACC-83细胞凋亡,并且随作用时间延长,诱导早期凋亡率增加,细胞早期凋亡率分别为(3.93±0.67)%、(5.86±1.26)%及(8.34±1.85)%,与对照组比较差异有统计学意义(均P﹤0.01)。(3)形态学可见典型的凋亡改变,表现为细胞膜完整,细胞质固缩,胞核固缩或碎裂,可见凋亡小体。(4) Western blot方法测得熊果酸下调ACC-83细胞的Bcl-2和COX-2的蛋白表达,随着药物浓度增加逐渐降低;Bax的表达并无明显改变,同时活化Caspase-3蛋白(P﹤0.05)。结论熊果酸能够抑制ACC-83细胞的增殖,并使细胞大量累积于S期,熊果酸可能通过下调COX-2和Bcl-2的表达水平、降低Bcl-2/Bax比例及活化Caspase-3来诱导ACC-83细胞凋亡。
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