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目的:研究原发性肝癌的发生与幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)感染的相关性,并初步探讨其分子机制机制。方法:第一部分1、PCR和测序分析检测肝组织幽门螺杆菌:对80例原发性肝癌行手术切除的患者,取其肝癌组织和癌旁组织标本,用DNAzol提取组织DNA,采用巢式PCR方法,扩增螺杆菌属特异的16SrRNA基因,30例正常肝组织为对照组。对螺杆菌16SrRNA基因扩增阳性的标本送测序,测序结果与来自GenBank中的其它种属螺杆菌序列进行同源性比较,进一步以H.pylori(基因号AF302106)相应序列为基础,用BioEdit软件对所扩增的DNA序列进行比较分析。继而取巢式PCR扩增阳性,来源于不同患者的癌组织或癌旁组织的标本DNA ,PCR扩增幽门螺杆菌特异26Kda蛋白基因和4个相关功能基因(cagA、vacA、rps4、glmM ),以进一步确定检出的细菌为幽门螺杆菌。2、免疫组化技术检测肝组织幽门螺杆菌:以兔抗幽门螺杆菌抗体,通过免疫组化技术,检测80对肝癌及癌旁组织标本。第二部分1、幽门螺杆菌对HepG2肝细胞增殖的影响:采用不同量的幽门螺杆菌(国际标准株NCTC11637)作用于HepG2肝细胞,CCK-8法检测细胞的增殖情况并确定最佳的幽门螺杆菌作用剂量。2、应用Affymetrix人类基因表达谱芯片检测幽门螺杆菌对HepG2细胞基因表达谱的影响,并应用RT-PCR半定量技术验证部分基因芯片的检测结果。第三部分1、幽门螺杆菌感染与原发性肝细胞癌侵袭转移的相关性。2、免疫组化技术检测Transgelin在高转移和低转移肝癌组织中的表达差异;3、免疫组化技术检测整合素(integrin)在高转移和低转移肝癌组织中的表达差异。结果:第一部分80例肝癌患者中有57例在癌组织和/或癌旁组织中检出螺杆菌基因,检出率为71.25%。39份癌组织标本检出螺杆菌基因,阳性率为48.75%, 38份癌旁组织标本检出螺杆菌基因,阳性率为47.5%。正常肝组未检出螺杆菌基因。与癌组织和癌旁组织差异有统计学意义(P<0.01)。对57位螺杆菌16S rRNA基因阳性患者的基因扩增产物进行测序分析,结果显示与H.pylori同源性最高,均超过99%;同时对此57份标本DNA进行幽门螺杆菌特异基因的扩增,结果显示能检出5种幽门螺杆菌基因中致少1种的共有48份,检出率84.21%。26KDa基因阳性率77.19%(44/57),cagA基因阳性率21.05%(12/57),glmM基因阳性率17.5%(10/57);多次扩增均未检出vacA基因和rps4基因。这些结果证实检测出的螺杆菌为幽门螺杆菌。免疫组化结果显示:80例肝癌患者中有39例在癌组织和/或癌旁组织中观察到了弯曲状或杆状的幽门螺杆菌存在,检出率为48.75%。癌组织标本免疫组化阳性率为32.5%,癌旁组织标本阳性率为30.0%。正常肝组织中未观察到了幽门螺杆菌的存在,与癌组织和癌旁组织差异有统计学意义(P<0.01)。免疫组化阳性的标本PCR结果全阳性。细菌主要位于肝窦内,亦有些位于汇管区内。第二部分MOI比值(细菌与细胞的个数比)在0.15:1~0.075:1时,幽门螺杆菌对HepG2细胞具有明显的促增殖作用。表达谱基因芯片结果提示, HepG2细胞经一定浓度(MOI比值为0.15:1)幽门螺杆菌处理后35个基因转录发生变化(上调19个,下调16个),其中与细胞骨架/基质有关的基因6个,DNA结合蛋白以及转录因子8个、细胞因子2个。选定其中的5个基因采用RT-PCR法检测相关基因的表达,与表达谱芯片检测结果完全吻合。第三部分高侵袭性组原发性肝细胞癌的幽门螺杆菌16s rRNA阳性率显著高于低侵袭性组(分别为86.44%和58.06,P<0.01)。免疫组织化学结果提示幽门螺杆菌16s rRNA阳性的原发性肝癌标本中Transgelin及Integrinα2的表达水平均显著高于16s rRNA阴性标本。结论:1、肝癌组织内存在幽门螺杆菌,幽门螺杆菌的感染与原发性肝癌可能存在某种相关性。2、一定剂量的幽门螺杆菌可促进肝细胞增殖,幽门螺杆菌对HepG2细胞功能具有广泛的影响3、幽门螺杆菌感染与肝癌的侵袭转移密切相关,其机制可能在于幽门螺杆菌促进肝细胞Transgelin及Integrinα2的表达。