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目的:研究CD11b对M1型巨噬细胞极化及髓源性抑制细胞(MDSCs)募集的调控机制及其对内毒素休克发病的影响,为内毒素休克的干预和治疗提供理论依据。方法:1.用同一浓度CD11b激动剂Leukadherin-1(40μg/g,LA1)预处理C57BL/6小鼠2小时,注射不同浓度致死剂量LPS(25,37.5和50μg/g),观察小鼠死亡率;用不同浓度LA1(10,20和40μg/g)预处理小鼠2小时,注射同一浓度致死剂量LPS(37.5μg/g),观察小鼠死亡率。2.用不同浓度的LA1预处理小鼠,2小时后用LPS建立内毒素休克模型。(1)病理切片H&E染色观察小鼠肝肺组织损伤情况。(2)TUNEL检测肝肺组织细胞凋亡情况。(3)流式细胞术检测M1型巨噬细胞的活化标志CD86和CD40的表达。(4)ELISA检测小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的含量。(5)qRT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表达。3.用GM-CSF诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),不同浓度梯度LA1处理BMDMs。通过显微镜观察细胞形态,CCK8检测细胞活力,确定合适的浓度。4.不同浓度LA1处理BMDMs 2小时,随后用LPS/IFN-γ刺激(1)流式细胞术检测BMDMs活化标志CD86和CD40的表达。(2)ELISA检测BMDMs培养上清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的蛋白水平表达。(3)qRT-PCR检测BMDMs中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表达。(4)Western blot检测BMDMs中磷酸化的p38、ERK1/2、JNK和p65蛋白水平的表达。5.将未处理和LA1处理2小时的BMDMs分别回输两组小鼠,随后用LPS建立内毒素休克的模型。(1)病理切片HE观察小鼠肝肺组织损伤。(2)TUNEL检测肝肺组织细胞凋亡。(3)ELISA检测炎症因子IL-6、TNF-α和IL-12蛋白水平的表达。6.(1)LPS处理BMDMs,流式细胞术检测细胞表面TLR4和CD11b的表达。(2)LPS注射小鼠,流式细胞术检测腹腔和外周血巨噬细胞表面TLR4和CD11b的表达(3)LPS处理BMDMs,免疫荧光共聚焦观察TLR4及CD11b内化情况。7.(1)LA1处理BMDMs,流式细胞术检测细胞表面TLR4和CD11b的表达。(2)LA1注射小鼠,流式细胞术检测外周血巨噬细胞表面TLR4及CD11b的表达情况。(3)CO-IP验证TLR4与CD11b间有无相互作用。8.LA1不同时间点注射小鼠,流式细胞术检测脾脏细胞中MDSCs及其分型细胞的比例。9.LA1预处理后,流式细胞术检测内毒素休克小鼠脾脏细胞中MDSCs及其分型细胞的比例。10.用GM-CSF和IL-6体外诱导MDSCs,随后用LA1处理MDSCs。qRT-PCR检测免疫抑制相关因子IL-10、NOX-1、iNOS及Arg-1 mRNA水平的表达。结果:1.LA1可降低LPS介导的内毒素休克小鼠的死亡率。2.(1)H&E显示LA1可减轻内毒素休克小鼠肝肺组织损伤。(2)LA1减轻内毒素休克小鼠肝肺组织细胞细胞凋亡。(3)LA1可降低巨噬细胞CD86和CD40的表达。(4)LA1可降低血清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的表达。(5)LA1可降低腹腔巨噬细胞中L-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表达。3.高浓度的LA1(≥40μM)减弱BMDMs的细胞活力,合适的浓度为20μM以下。4.(1)LA1可降低BMDMs表面CD86和CD40的表达。(2)LA1可降低BMDMs培养上清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的表达。(3)LA1可降低BMDMs中TNF-α和IL-12 mRNA水平的表达。(4)LA1可降低p38、ERK1/2、JNK和p65的磷酸化水平。5.(1)回输LA1处理的BMDMs可减轻内毒素休克小鼠的肝肺组织损伤.(2)回输LA1处理的BMDMs可减轻内毒素休克小鼠肝肺组织细胞凋亡。(3)回输LA1处理的BMDMs可降低IL-6、TNF-α和IL-12蛋白水平的表达。6.(1)LPS/IFN-γ可降低BMDMs表面TLR4和CD11b的表达(2)LPS可降低小鼠腹腔和外周血巨噬细胞表面TLR4和CD11b的表达(3)LPS/IFN-γ刺激BMDMs后,免疫荧光显微镜观察到TLR4与CD11b的内化7.(1)LA1可降低BMDMs表面TLR4和CD11b的表达(2)LA1可降低外周血巨噬细胞TLR4和CD11b的表达(3)LA1处理后,免疫荧光显微镜观察到CD11b与TLR4的内化(4)CO-IP证实CD11b与TLR4之间有相互作用8.LA1可增加脾脏MDSCs及G-MDSCs的比例9.LA1增加内毒素休克小鼠脾脏MDSCs及G-MDSCs的比例10.LA1可增加MDSCs中IL-10、NOX1及iNOS mRNA水平的表达。结论:1.LA1激动CD11b可抑制信号通路蛋白p38、JNK、ERK1/2和p65磷酸化,进而抑制巨噬细胞的活化并缓解LPS介导的内毒素休克。2.LA1激动CD11b可促进MDSCs及G-MDSCs的聚集并缓解LPS介导的内毒素休克。