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目的:白芍总苷(Total glucosides of paeony,TGP)是白芍的有效部位,主要含有芍药苷(paeoniflorin,Pae)、芍药内酯苷(albiflorin,Alb)等单萜类成分。现代药理学研究证实TGP具有明显的保肝作用,能显著对抗多种因素所致的急慢性肝损伤、肝纤维化等。课题组前期对TGP在正常和病理状态下的吸收、分布、排泄进行了系统性的研究,并对白芍总苷在大鼠体内的代谢产物进行了分析。细胞色素P450酶是机体内最重要的药物代谢酶,参与药物及各种内源性、外源性化合物在体内的代谢过程。因此为了更深入的了解TGP在大鼠体内的代谢过程,本实验进一步研究了TGP对细胞色素P450酶的影响,分别采用Western Blot和RT-PCR两种方法从蛋白和m RNA两个层面研究TGP对正常大鼠和CCl4肝损伤大鼠6种细胞色素P450亚型酶CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1的影响,以期探讨白芍总苷对大鼠细胞色素P450的调控作用。方法:1白芍总苷对正常大鼠6种CYP450亚型酶的影响1.1实验动物分组与给药健康Wistar大鼠25只,♂,体重(180~220)g,随机分为5组:空白对照组,TGP低、中、高剂量给药组,阳性给药组。每组5只,正常对照组给予纯化水,TGP低、中、高给药组灌胃给予TGP 0.47 g/kg、1.41 g/kg、2.82 g/kg,阳性对照组腹腔注射地塞米松注射液75 mg/kg,连续14天,末次给药24 h后断头处死各组大鼠,迅速取肝,4℃预冷生理盐水中冷却,吸干水分,称重,将肝组织剪碎,洗净血液,分装于冻存管中,液氮速冻,-80℃保存备用。1.2蛋白免疫印迹法测定6种CYP450亚型酶蛋白表达采用差速离心法制备肝微粒体。肝组织按1:4(g:m L)加入0.25 mol/L蔗糖溶液,匀浆器制备肝匀浆,9000 g离心20 min,取上清液于19000 g离心20 min,再次取上清液60000 g离心60 min,下层粉红色沉淀即为肝微粒体,沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl(含20%甘油,p H=4)混悬均匀,分装,干冰速冻,-80℃贮存备用,采用Branford方法测定肝微粒体的蛋白浓度。Western Blot法检测TGP对CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1蛋白表达的影响1.3 RT-PCR法测定6种CYP450亚型酶m RNA表达应用Omiga2.0引物设计软件进行引物设计。采用Trizol法提取肝脏中的RNA。取100 mg肝组织于研钵中研磨至粉末状,转移至EP管中,加入1 m L Trizol室温下放置5 min,再加入氯仿0.2 m L,剧烈颠倒混匀,室温放置5 min,4℃,12000 g离心15 min,转移上层水相400μL于另一新1.5 m L EP管中,加等体积异丙醇混匀后-20℃放置30min,然后4℃,12000 g离心10 min,弃上清,加冰预冷的75%乙醇1m L洗涤RNA,4℃,7500 g离心5 min,弃上清,在超净台中自然风干RNA沉淀至沉淀呈半透明状态,水浴55℃、5 min即得总RNA。按照Promega Goscript反转录系统说明书和北京鼎国昌盛生物技术有限公司2×Taq PCR Green Mix说明书进行逆转录和扩增反应。2白芍总苷对CCl4肝损伤大鼠6种CYP450亚型酶的影响健康Wistar大鼠30只,♂,体重(180~220)g,按体重随机分为6组:正常对照组,模型对照组,TGP低、中、高剂量组、阳性对照组。每组5只,正常对照组与模型对照组给予纯化水,TGP低、中、高剂量组分别灌胃给予TGP水溶液(剂量同1.1),阳性对照组给予联苯双酯滴丸水溶液0.2 g/kg体重,连续14天,除正常对照组大鼠注射等量生理盐水外,其余各组均于末次给药2 h后,皮下注射50%CCl4玉米油溶液10m L/kg(CCl4:玉米油=1:1),16 h后将大鼠断头处死(实验前禁食16 h,自由饮水)。取血,分离血清测定ALT、AST;取肝,称总重,计算肝脏系数;肝左叶的相同部位用10%甲醛溶液固定,常规石腊包埋,HE染色,光镜下观察组织损伤程度;将剩余肝组织剪碎,洗净血液,分装于冻存管中,液氮速冻,-80℃保存备用。蛋白免疫印迹法测定TGP对CCl4肝损伤大鼠6种细胞色素P450亚型酶CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1蛋白表达的影响,RT-PCR法测定TGP对CCl4肝损伤大鼠六种CYP450亚型酶m RNA表达的影响。结果:1白芍总苷对正常大鼠CYP450亚型酶的影响与正常对照组相比,阳性对照组给予地塞米松能够显著上调CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及m RNA表达水平(P<0.01),TGP低、中、高剂量组较正常对照组均有增高趋势,高剂量组能显著增加CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及m RNA表达量(P<0.01)。TGP对CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19蛋白及m RNA表达无明显影响。2白芍总苷对急性CCl4肝损伤大鼠6种CYP450亚型酶的影响2.1 TGP对急性CCl4肝损伤大鼠肝脏系数的影响大鼠皮下注射CCl4后,模型组大鼠肝脏系数较正常对照组明显上升,显著高于正常对照组(P<0.01);与模型组比较,预先给予TGP或DDB能显著降低肝损伤所致的肝脏系数上升(P<0.05或P<0.01)。2.2 TGP对CCl4所致大鼠急性肝损伤肝功能的影响与正常对照组比较,模型组大鼠ALT、AST值明显升高(P<0.01);与模型组比较,预先给予TGP或DDB能够显著降低ALT、AST水平(P<0.05或P<0.01),且TGP阳性对照组和高剂量组效果明显优于TGP低、中剂量组。2.3 TGP对CCl4所致大鼠急性肝损伤模型肝组织病理学观察正常对照组大鼠肝脏形态正常,色泽红润,边缘整齐,质地柔软;镜下可见肝小叶结构完整,肝细胞形态正常,肝细胞索清晰可辨。模型组大鼠肝脏体积肿大,呈土黄色,边缘变钝,质脆;镜下见肝小叶失去正常结构,肝组织结构紊乱,肝细胞普遍变性,出现广泛的肝细胞脂肪变性、空泡变性和弥散性的肝细胞坏死。TGP各给药组和阳性对照组均能不同程度地改善上述病理改变,减轻肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理变化。2.4 TGP对急性CCl4肝损伤大鼠CYP450亚型酶的影响大鼠皮下注射CCl4后,与正常对照组相比,模型组CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及m RNA表达明显减少(P<0.01);阳性对照组给予DDB明显诱导CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及m RNA表达(P<0.01);TGP低、中、高剂量组亦能增加CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及m RNA的表达量。结论:1 TGP可诱导正常大鼠CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白和m RNA表达。2 CCl4能显著降低模型组大鼠CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及m RNA表达水平,预防性给予大鼠低、中、高剂量TGP连续14天,TGP可明显对抗CCl4所致的大鼠急性肝损伤,上调CCl4所致肝损伤CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1蛋白及m RNA表达水平。以上结果表明,TGP对CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1有诱导作用。