囊泡运输是细胞生命活动的基础,是各种生理活动正常运行的保障,与许多疾病的发生密切相关。根据目的地不同,囊泡运输可分为胞吐途径和胞吞途径,涉及到囊泡与胞内细胞器以及质膜的直接作用,为胞内复杂的分子网络所调控。当前对囊泡运输的研究已经确认了许多起调控作用的蛋白分子,但某些调控蛋白的具体作用位点和分子机制尚不清楚。本文利用来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的PC12细胞和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)分别对胞吐和胞吞途径中的重要调控蛋白SynaptotagminⅦ(SytⅦ)和SEC-10的作用机制做了进一步的研究,特别是在秀丽线虫中的工作克服了传代细胞不能直接联系生物体表型和行为的缺点,在活体中比较了不同类型细胞里SEC-10的胞吞机制差异,揭示了exocyst在胞吞途径中新的作用。在培养的PC12细胞中研究了SytⅦ对致密核心囊泡(DCVs)胞吐过程的影响。SytⅦ因其具有比SytⅠ和SytⅨ更高的钙离子亲和力,以及在与脂质结合后表现出更慢的解离动力学过程,被认为在DCVs分泌的慢速动力学过程中起着钙离子感受器的作用,而并不参与突触囊泡的快速分泌过程。但迄今为止,SytⅦ的亚细胞定位及其生理学功能仍未完全清楚。我们首先应用全内反射荧光显微镜技术表明,在PC12细胞中SytⅦ定位于DCVs;又通过综合运用高时间分辨率的细胞膜电容测量和碳纤维微电极安培检测,确定了单独沉默内源性的SytⅦ就可以明显减少PC12细胞中钙触发的DCVs与质膜的融合并抑制了融合孔的开放,特别是减少了DCVs胞吐触发相的幅值,而对于其持续成分的速率则几乎没有影响。这些发现提示我们SytⅦ在PC12细胞DCVs融合机制中作为钙感受器,对可释放DCVs库的形成和维持起着非常重要的作用。本文的主要工作为在模式生物秀丽隐杆线虫中研究了SEC-10对于线虫整体行为以及各种生命表征正常维持的重要性,特别是在不同的胞吞模型细胞中,较为深入细致地研究了SEC-10对细胞内吞及内吞后的胞内运输的调控功能,并探索其可能的分子机制。SEC-10是Exocyst蛋白质复合体的八个亚基成员之一,Exocyst (Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70, Exo84)已经被很多研究证明在细胞胞吐途径上的囊泡栓系环节中发挥着重要作用,是胞吐过程的一个关键蛋白复合物。但对于Exocyst在胞吞途径中的作用,近年来虽然已有少量报道,但其明确的功能与分子机制还远不清楚。这里我们通过TMP-UV的方法,完成了国内第一个线虫基因突变库的构建,并在此基础上筛选出了第一个缺失突变的线虫种系sec-10突变体。通过对sec-10突变体表型和行为学的分析,发现SEC-10可能在生物体的多个组织与细胞中发挥作用,SEC-10的缺失会严重影响线虫的胚胎发育,造成胚胎致死,这与鼠和果蝇中的研究基本一致,提示我们Exocyst在动物发育过程中的重要性。另外,在非极性的腔胞细胞(coelomocytes)、极性的肠细胞(intestinal cells)以及卵母细胞(oocytes)中,我们通过荧光标记各种胞吞途径相关的细胞器,分别开展了胞吞动力学跟踪试验,表明SEC-10在不同类型细胞的胞吞途径中都发挥着极其重要的作用。首先,在腔胞中的研究发现：1.通过特异性抑制腔胞细胞中网格蛋白(clathrin)依赖的小胞饮作用(micropinocytosis)和网格蛋白非依赖但amiloride敏感的巨胞饮(macropinocytosis)作用,发现二者皆为腔胞胞吞的重要途径,且吸收较小分子量的亲水物质时两个途径可以相互补偿,但吸收较大分子量的亲水物质时则主要依赖巨胞饮作用；2.sec-10突变使腔胞细胞中网格蛋白依赖的小胞饮作用和网格蛋白非依赖但amiloride敏感的巨胞饮作用都被严重破坏,使胞吞相关分子定位和形态异常,极大阻遏了细胞胞吞的早期步骤,导致sec-10突变线虫出现明显的Cup表型；3.sec-10基因突变的线虫腔胞中,胞吞相关的细胞器分布和形态异常,但分子胞吞后到达溶酶体的运输途径正常,推测细胞器的异常是sec-10突变阻遏胞吞早期步骤导致。此外,线虫的肠细胞是一个极佳的极性上皮细胞模型。我们的研究发现：1.SEC-10在线虫不同生长时期的肠细胞中有大量表达,且其功能缺失突变会导致线虫节律性的排便周期延长,说明SEC-10在线虫肠部可能发挥着重要作用；2.在极性肠细胞中SEC-10的作用表现出明显的极性,即只影响基底面的胞吞后转运,但不影响顶面胞吞途径。3.sec-10基因的突变破坏了肠细胞基底膜上受体蛋白内吞后从早期内涵体向循环内涵体的转运,且依赖网格蛋白和不依赖网格蛋白胞吞的膜蛋白的胞吞后循环都需要SEC-10；4.胞吞动力学跟踪实验和荧光融合蛋白标记实验表明,SEC-10的功能缺失不仅阻碍了肠细胞基底面的循环途径,还改变了被内吞物质再循环的命运,转而运往溶酶体降解途径。总而言之,本论文工作首次以SEC-10缺失突变体线虫为研究对象,不仅从亚细胞水平上分析了有大量胞吞活动的极性和非极性细胞,较好的阐述了SEC-10在线虫中不同组织和细胞类型的胞吞途径上的作用机制,而且从整体上分析了活体成年线虫的表型与行为学差异。我们发现并提出了Exocyst复合物在胞吐途径之外的其它囊泡运输过程中也具有重要的功能,为深入研究Exocyst在胞吞途径中的分子机制,以及进一步全面了解它在高等哺乳动物体中的各种功能提供了新的证据和线索。