论文部分内容阅读
随着工业机械化和运输业的发展,人们获得高风险工作的机会越来越多,出现脊髓和周围神经损伤的概率大大增加,周围神经损伤已成为世界上最严重的健康问题之一。神经系统修复自身神经损伤的能力有限,通常需要外部辅助治疗。目前,临床修复周围神经缺损的主要方法是断续再连接,但断续时过度紧张可能会导致继发性神经元坏死。异体或异种神经是理想的神经源,但是治疗失败通常会导致严重的免疫排斥。因此,修复神经是最具挑战性的领域之一。组织工程学是生命科学和材料科学的跨学科领域,并为神经细胞的植入提供了潜在的替代平台。3D生物打印可以将混有细胞的生物材料准确地构建为具有复杂结构的仿生支架。与传统构造组织工程仿生支架的方法相比,它具有更丰富和多样的支架形态,可支持更广泛的应用。由于其在材料制备中具有快速的原型制作和控制能力,因此3D生物打印为开发可用于治疗特定患者的不同类型的神经支架开辟了新的前景,3D生物打印技术在医疗组织工程应用中具有巨大潜力。3D生物打印技术研发制备功能性活组织的一大重点是需要有优异性能的生物墨水。本文首先通过离子液体分散石墨烯（Gr）,制备石墨烯分散体系,使得石墨烯的团聚效应大大减少,有利于后续水凝胶的打印。之后将明胶（Gel）和海藻酸钠（SA）混入石墨烯分散体系得到混合生物墨水,使用流变仪等仪器对生物墨水进行一些表征分析。进行了可打印性分析,得到最佳打印性条件为:Gel=6%、SA=2%且Ca2+=2%;就材料的流变性而言,交联前后生物墨水的粘弹性和稳态粘度有明显的变化,海藻酸钠经过Ca2+交联之后使得支架有稳定的结构和较强的力学性能,从而其粘弹性和稳态粘度都有明显的增强;海藻酸钠溶液的储能模量随温度的变化不大,说明海藻酸钠温敏性较弱,生物墨水的温敏性取决于明胶,而明胶的储能模量随温度的降低而明显增高,在22℃左右会有一个临界点,说明生物墨水在此种状态下开始慢慢凝胶;用傅里叶红外光谱仪检测交联反应的结果,检测发现有2940 cm-1、890 cm-1和950 cm-1波数这三个特征吸收峰;为了打印出最佳状态的支架,本文参考生物墨水的综合性能对打印机的针筒和平台温度、打印速度、打印压力及填充间距等等参数进行了调节。本文进而介绍了复合支架的制备及表征。由于3D打印操作,支架会形成排列整齐的大孔,孔径大致为300微米,支架还会因为自身水凝胶的特性,形成直径在50到100微米的小孔,高度多孔的支架能够在培养细胞时使得营养物质顺利传递以及清除细胞代谢垃圾,这样可以更好的培养细胞。石墨烯的添加增加了支架的机械强度,但是机械强度并未无限增加。支架的吸水率随石墨烯的增加略有下降,因此含有石墨烯的支架的吸水能力降低。96小时后,Gel/SA,0.02%Gr/Gel/SA,0.08%Gr/Gel/SA和0.2%Gr/Gel/SA支架的吸水率分别为1100.5±18.96%,1041.2±11.21%,1019.5±29.65%和1031.8±15.54%。添加少量石墨烯不会引起支架孔隙率的显着变化,然而,随着石墨烯含量的增加,支架的孔壁变厚,这导致支架的孔隙率略微降低。Gel/SA,0.02%Gr/Gel/SA,0.08%Gr/Gel/SA和0.2%Gr/Gel/SA支架的孔隙率分别为89.01±1.02%,89.98±0.56%,76.99±2.41%和65.47±3.15%。石墨烯的添加增加了材料的无机含量,并使材料的亲水性变差,所以孔隙率变小,导致降解变慢,最终导致支架降解率降低。Gel/SA,0.02%Gr/Gel/SA,0.08%Gr/Gel/SA和0.2%Gr/Gel/SA支架的降解15天之后的降解率分别为70.32%,62.79%,58.25%和52.54%。随着石墨烯含量的增加,支架的接触角变得越来越大,表明该材料的亲水性变得越来越差。Gels/SA,0.02%Gr/Gel/SA,0.08%Gr/Gel/SA和0.2%Gr/Gel/SA支架的接触角分别为56.21±1.24°,64.38±2.45°,96.20±0.25°和116.37±3.54°。本文使用的PC12细胞生长良好,细胞状态稳定,可以很好的进行实验。当在支架上接种PC12细胞5天后,取出细胞—支架复合物,处理好固定在显微镜下,可以观察到细胞在支架上很好的增殖,在支架上黏附的细胞清晰可见,细胞生长旺盛的支架还可以看到在叠层生长。细胞在支架上培养五天后,用荧光显微镜对细胞在支架上生长做了定性的考察,观察的结果显示,PC12细胞具有很好的生长状态。在荧光图片中可以观察到大量的活细胞,几乎看不到死细胞,细胞已经在支架上铺展生长开来,开始生长到细胞的内部;通过Calcein-AM染色、PI染色和Hochest 33258三种染色发现,可以定性的看出支架上的细胞生长良好,具有很高的活性;在每组支架上生长的细胞也会随着一天一天的培养,其数量也会越来越多。而Gels/SA支架上的细胞与Gr/Gel/SA支架相比,细胞数量较少。Gr/Gel/SA支架上细胞更加密集,经过长时间的培养,过高的石墨烯含量将对细胞产生越来越大的负面影响,支架的细胞毒性从CCK的定量考察可以得出,相较于不含石墨烯的支架,添加石墨烯的支架更有利细胞的生长,但是过多的石墨烯反而会抑制细胞增殖。综合考虑得出石墨烯含量为0.08%的支架最适于接种PC12细胞。