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背景和目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是癌症相关死亡的第四大最常见的死因,但其发病机制至今尚未明确。细胞色素P450氧化酶（CYP）1A2是重要的肝脏药物代谢酶,我们前期研究发现,肝癌组织中CYP1A2的表达显著下调,过表达CYP1A2抑制肝癌细胞的增殖、侵袭与迁移,CYP1A2很有可能成为潜在的HCC早期诊断及治疗靶标,但CYP1A2在HCC中下调的机制尚不清楚。表观遗传学为在基因的核苷酸序列不发生改变的前提下,基因的表达发生了可遗传的改变,其中DNA甲基化和组蛋白修饰作为重要的表观遗传机制在基因表达调控中发挥着重要作用。文献报道,人胚胎干细胞衍生肝细胞及肺癌细胞中DNA甲基化、组蛋白修饰参与CYP1A2的表达调控。我们前期研究发现,DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（Decitabine,DAC）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）均显著增加肝癌细胞CYP1A2的表达,表明表观遗传调控在肝癌CYP1A2的表达抑制中起作用,但具体机制尚不清楚。索拉非尼作为首个被FDA批准,可用于晚期HCC一线治疗的多激酶抑制剂,但其延长生存期十分有限,易出现耐药。提高HCC细胞对索拉非尼的敏感性,减弱索拉非尼耐药性是近年来研究的热点。但表观遗传药物与索拉非尼联合用药是否能够提高HCC细胞对索拉非尼的敏感性,减弱其耐药性尚不清楚。因此,本课题拟研究:肝癌中CYP1A2表达下调的表观遗传学机制;表观遗传药物是否能增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性。方法1.肝细胞癌组织样本收集:本项目共收集64例配对人肝组织样本,包括48例HBV相关原发性肝细胞癌（HBV-related hepatocellular carcinoma,HBV-HCC）、8例复发HBV相关原发性肝细胞癌（HBV-related Recurrent hepatocellular carcinoma,HBV-RHCC）、3例非HBV相关原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）、2例原发性胆管细胞癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）及3例转移性肝癌（Metastatic liver cancer,MLC）。2.q RT-PCR、Western blotting和免疫组化检测配对肝癌和癌旁组织中的CYP1A2的m RNA和蛋白表达水平,Spearman相关分析分析肝癌组织CYP1A2m RNA和蛋白表达相关性。3.Western blotting检测配对肝癌和癌旁组织DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）3a、3b蛋白表达水平,甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）检测肝癌和癌旁组织CYP1A2基因转录起始位点两个核心Cp G位点甲基化水平。4.不同浓度甲基转移酶抑制剂DAC处理肝癌细胞Hep G2和LM3后,q RT-PCR检测CYP1A2和CYP1A2相关转录因子AHR、HNF3β、HNF4α和PXR的m RNA表达水平;Western blotting检测Dnmt3a、Dnmt3b和CYP1A2蛋白表达水平;MSP法检测肝癌细胞中CYP1A2转录起始位点两个核心Cp G位点甲基化水平变化。5.不同浓度组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理肝癌细胞HepG2和LM3后,q RT-PCR检测CYP1A2和CYP1A2相关转录因子AHR、HNF3β、HNF4α和PXR的m RNA表达水平;Western blotting检测CYP1A2蛋白表达水平;染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）检测2.5μmol/L TSA处理肝癌细胞后,CYP1A2启动子区AHR结合位点组蛋白修饰改变和AHR在CYP1A2启动子区的富集水平。6.用指数增长浓度梯度的索拉非尼（0μmol/L,1μmol/L,2μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,16μmol/L,32μmol/L,64μmol/L）单独或联合DAC/TSA处理肝癌细胞Hep G2和LM3,CCK8测定剂量-效应曲线,计算IC50值,观察克隆形成。结果1肝癌组织中CYP1A2的表达下调1.1配对肝癌和癌旁组织中CYP1A2 m RNA水平在64例配对人肝组织样本中,肝癌组织中CYP1A2 m RNA的表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.0001）,低表达率为91.4%。1.2配对肝癌和癌旁组织中CYP1A2蛋白水平Western blotting结果显示在64例配对人肝组织样本中,60例肝癌组织（占比93.8%）CYP1A2蛋白表达水平低于癌旁组织。在HBV-HCC、HBV-RHCC、HCC、ICC和MLC五个分类配对人肝组织中,CYP1A2蛋白在42例配对HBV-HCC组织中表达下调（共48例）,低表达率为91.7%,其他四个分类中CYP1A2表达均表现为全部降低。免疫组化结果与Western blotting检测结果一致。1.3肝癌组织中CYP1A2 mRNA和蛋白表达相关性64例肝癌组织中CYP1A2 m RNA和蛋白表达水平呈正相关,但相关性较弱（r=0.276;P=0.031）。2肝癌中CYP1A2低表达表观遗传机制研究2.1 DNA甲基化调控CYP1A2的表达2.1.1肝癌组织Dnmt3a和Dnmt3b的表达水平Western blotting检测发现在20对配对人肝组织中,有14例（70%）肝癌组织中Dnmt3a蛋白表达水平明显增高,然而Dnmt3b仅在6例（30%）肝癌组织中蛋白表达水平增高。2.1.2肝癌中DNA异常甲基化参与调控CYP1A2表达水平26对配对样本MSP结果显示,与癌旁组织相比,肝癌组织中CYP1A2基因转录起始位点两个核心Cp G位点甲基化率显著增高（P=0.0044）。在肝癌组织中CYP1A2 m RNA低表达的23对样本中,有18例（78.2%）CYP1A2基因核心Cp G位点甲基化率增高,而在3对CYP1A2 m RNA高表达的肝癌组织中,甲基化率均降低。表明肝癌组织中CYP1A2的转录抑制可能与Dnmt3a的高表达导致CYP1A2转录起始位点两个核心Cp G位点高甲基化相关。2.1.3甲基转移酶抑制剂DAC对肝癌细胞CYP1A2表达的影响与对照组相比,不同浓度DAC均可诱导Hep G2细胞CYP1A2 mRNA和蛋白的表达,其中5μmol/L DAC对CYP1A2 m RNA（1.9~2.8倍,P=0.002）的诱导作用最强,0.5μmol/L DAC对CYP1A2蛋白（1.5~2.1倍,P=0.021）的诱导作用最强;在LM3细胞中,0.5μmol/L DAC对CYP1A2 m RNA诱导作用最强（约3倍,P=0.021）,由于CYP1A2蛋白在LM3细胞中表达过低而未检测到。2.1.4甲基转移酶抑制剂DAC对肝癌细胞Dnmt3a和Dnmt3b表达的影响2.5μmol/L与5μmol/L DAC分别处理肝癌细胞Hep G2和LM3后,Western blotting检测发现DAC对肝癌细胞中的Dnmt3a和Dnmt3b的蛋白表达水平没有影响。2.1.5甲基转移酶抑制剂DAC处理肝癌细胞后CYP1A2基因甲基化状态分析不同浓度DAC处理肝癌细胞Hep G2和LM3后,MSP法检测CYP1A2两个核心Cp G位点甲基化程度,发现5μmol/L DAC处理后,甲基化率下降最明显,Hep G2细胞表现为完全去甲基化,与对照组相比,甲基化率下降26.1%;LM3细胞表现为部分去甲基化,和对照组相比,甲基化率下降13.7%。2.1.6甲基转移酶抑制剂DAC对肝癌细胞CYP1A2相关转录因子表达的影响2.5μmol/L与5μmol/L DAC分别处理肝癌细胞Hep G2和LM3后,均可诱导肝癌细胞中CYP1A2相关转录因子HNF3β、HNF4α、PXR与AHR m RNA的表达,5μmol/L DAC诱导作用最强。2.2组蛋白乙酰化修饰调控CYP1A2的表达2.2.1组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对肝癌细胞CYP1A2表达的影响不同浓度TSA处理肝癌细胞Hep G2和LM3后发现,2.5μmol/L TSA对Hep G2（2.14~3.46倍,P=0.02）和LM3（3.5~6倍,P=0.022）的CYP1A2 m RNA诱导作用最强。不同浓度TSA均增加Hep G2细胞CYP1A2蛋白表达,其中1μmol/L TSA诱导作用最强（约2倍,P=0.014）。由于CYP1A2蛋白在LM3细胞中表达过低而未检测到。影响2.2.2组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对肝癌细胞CYP1A2相关转录因子表达的1μmol/L与2.5μmol/L TSA分别处理肝癌细胞HepG2和LM3后,2.5μmol/L TSA对Hep G2细胞AHR、HNF3β和HNF4αm RNA诱导作用最强,LM3细胞中,仅2.5μmol/L TSA处理后AHR m RNA被显著诱导。2.2.3组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理肝癌细胞后CYP1A2启动子区组蛋白修饰的差异2.5μmol/L TSA处理HepG2细胞后,ChIP-qPCR检测发现CYP1A2启动子区H3K27Ac的富集增加,而H3K9Ac和H3K4me3富集水平没有改变,提示TSA对诱导CYP1A2表达与H3K27Ac富集增加相关。2.2.4组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对肝癌细胞CYP1A2启动子区转录因子的富集的影响2.5μmol/L TSA处理HepG2后,ChIP-qPCR结果显示,与对照组相比,AHR在CYP1A2启动子区7处不同AHR结合区域的富集水平均没有改变。所以我们推测可能AHR在CYP1A2启动子区其他的位点发挥了作用,或者其他转录因子富集于CYP1A2启动子区诱导CYP1A2的表达水平,需要进一步实验验证。3表观遗传药物增加HCC细胞对索拉非尼敏感性CCK8实验检测发现索拉非尼和DAC/TSA联合用药组剂量-效应曲线明显左移。在Hep G2细胞中,联合用药DAC后索拉非尼IC50值由5.224μmol/L降至3.886μmol/L,在LM3细胞中,联合用药索拉非尼IC50值由10.91μmol/L降至7.56μmol/L。在Hep G2细胞中,联合用药TSA后索拉非尼IC50值由5.224μmol/L降至3.302μmol/L,在LM3细胞中,联合用药索拉非尼IC50值由16.32μmol/L降至12.07μmol/L。克隆形成实验显示,索拉非尼和DAC/TSA联合用药降低肝癌细胞的克隆形成能力。结论1.DNA高甲基化抑制肝癌CYP1A2表达:肝癌组织中Dnmt3a表达增高,使CYP1A2转录起始位点两个核心Cp G位点甲基化程度增高,抑制CYP1A2表达;DAC通过降低肝癌细胞CYP1A2基因核心Cp G位点甲基化水平诱导CYP1A2表达;2.TSA通过增加HCC细胞CYP1A2启动子区H3K27Ac修饰水平上调CYP1A2表达;3.表观遗传药物DAC/TSA与索拉非尼联用通过增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性,抑制HCC细胞克隆形成能力。