【摘 要】
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猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3,PCV3）是2015年新发现的致病性圆环病毒,其与已知的PCV1、PCV2以及后期发现的PCV4均无交叉反应性。猪圆环病毒病在世界范围内流行且传播途径广,在猪群患有其它疾病时易出现混合感染,增加猪群的发生率与死亡率。目前针对PCV3的疫苗研制尚在进行中,还没有商品化疫苗。因此,探究PCV3相关疫苗对疾病的防控至关重要。病毒样颗粒（Virus
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猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3,PCV3）是2015年新发现的致病性圆环病毒,其与已知的PCV1、PCV2以及后期发现的PCV4均无交叉反应性。猪圆环病毒病在世界范围内流行且传播途径广,在猪群患有其它疾病时易出现混合感染,增加猪群的发生率与死亡率。目前针对PCV3的疫苗研制尚在进行中,还没有商品化疫苗。因此,探究PCV3相关疫苗对疾病的防控至关重要。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）疫苗作为亚单位疫苗的一种,具有较好的免疫原性与安全性,因而研制PCV3的VLPs疫苗具有一定的应用前景。为了构建大肠杆菌系统表达Cap蛋白形成VLPs,本研究保留了PCV3完整的ORF2开放阅读框,对其进行全基因密码子优化后分别连接至p ET-30a及p ET-28a-SUMO两个大肠杆菌表达载体中进行Cap蛋白的表达,表达后蛋白均通过Ni柱亲和层析进行纯化。前者使用非变性裂解液洗脱杂蛋白,低浓度的5 m M咪唑洗脱目的蛋白获得了纯度较高的His-Cap蛋白,经透射电镜观察能够形成17-20 nm大小的VLPs;后者则通过20 m M咪唑洗脱液洗脱杂蛋白,500 m M咪唑浓度洗脱液洗脱目的蛋白成功纯化了His-SUMO-Cap蛋白,该重组蛋白因含有融合SUMO蛋白,于透射电镜下观察未能形成VLPs。两种蛋白的表达及纯化样品均通过western blot进行了鉴定,结果表明两种蛋白均可与猪源PCV3阳性血清发生特异性反应。为了评价Cap蛋白VLPs的免疫效果,本研究首先将实验室保存的用于分离PCV3-LJ0603株的组织病料经处理后感染2头断奶仔猪,回归本动物确定致病性,同时制备LJ0603株的组织毒用于建立小鼠感染模型。将脾脏组织毒同时通过肌注及口服的方式对仔猪进行感染。与对照组相比,感染组的2只仔猪能够观察到厌食消瘦、皮肤部分黄染等类似于猪皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis nephrotic syndrome,PDNS）的临床症状。组织剖检结果可见感染组仔猪各组织器官均有明显病变。病理切片结果也同样显示受检的各组织器官均发生了组织结构破坏及炎性细胞浸润等病理变化。表明了LJ0603株对断奶仔猪具有致病性。同时通过PCR及q PCR的检测方法对各感染组织进行了PCV3检测,证实了PCV3感染具有广泛的组织嗜性。对感染组猪血清进行q PCR及ELISA鉴定,结果显示血清中检测到PCV3基因组且血清抗体Ig G检测结果为阳性。利用感染的组织病料建立了PCV3感染小鼠的动物模型,经q PCR方法检测组织中PCV3病毒载量,在感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾各组织中均可检测到PCV3感染,且峰值位于感染后6-8 d,病毒载量最高可达7.5×10~4拷贝/m L。实验结果表明利用PCV3-LJ0603株感染小鼠,能够作为VLPs免疫效果检测的模型动物。为了评价Cap蛋白的免疫原性,分别将制备的Cap蛋白VLPs和His-SUMO-Cap蛋白与弗氏完全佐剂乳化后按照30μg/只的剂量对小鼠进行皮下注射免疫,并于2周后使用相同剂量经弗氏不完全佐剂乳化后进行二免,结果可见随着免疫时间延长,两组小鼠免疫后血清中均可检测到针对Cap蛋白的高水平Ig G抗体及含量显著增加的Th1型细胞因子γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）与α肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、Th2型细胞因子白细胞介素4（Interleukin 4,IL-4）,且VLPs组各项免疫指标均优于His-SUMO-Cap组。对免疫后小鼠进行攻毒保护实验,q PCR结果显示2组免疫小鼠各组织病毒载量相较于对照组均明显减少,且VLPs组免疫保护效果更优。实验结果表明制备的Cap-VLPs与His-SUMO-Cap两种蛋白免疫小鼠均可产生良好的免疫应答,其中VLPs的免疫原性更好。本研究通过大肠杆菌表达体系进行了PCV3-Cap蛋白的原核表达及纯化,成功制备了PCV3-VLPs,并将其用于免疫小鼠进行了免疫原性分析,证明了Cap-VLPs在PCV3疫苗研制方面的潜在价值;同时对LJ0603株PCV3进行了仔猪致病性研究,为PCV3的临床诊断提供了一定的理论依据。
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