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一、研究背景乳腺癌(breast cancer)是成年女性最常见的恶性肿瘤,其在欧美发达国家女性癌症发病率中位居首位,仅在美国乳腺癌约占所有女性中诊断出癌症患者的30%。我国虽在世界范围内仍属于乳腺癌发病率较低的国家,但是随着人们生活方式及环境等各类因素的改变,乳腺癌发病率在我国女性人群中呈现快速上升的趋势。近年来随着早期乳腺癌发现率的提高,手术方法的改进和综合治疗的应用,乳腺癌的治愈率有所提高,但术后复发及远处转移的问题仍是乳腺癌治疗的一大难题。而在早期诊断及治疗的乳腺癌患者中,约90%能够生存下来,因此寻找一种新型的基因诊断标记物对于乳腺癌的预防和治疗具有非常重要的意义。锌转运体(zinc transporter)是调节机体锌离子稳态的一种跨膜蛋白,包括两个大的基因家族：ZnT和ZIP。ZnT蛋白通过促进细胞质锌的外流及使锌在各细胞器内区室化,从而降低细胞浆锌的含量；ZIP蛋白起相反的作用,能够增加锌的内流摄取或者促进细胞器内锌的释放,来增加细胞浆中锌的含量。锌是生物体所必须的微量元素之一,是多种酶和蛋白质的重要组成部分,广泛参与生物体代谢,还涉及细胞的生长、增殖和分化。锌在细胞内外的再分布是维持生物体内锌稳定的基本环节,而锌转运体在维持这种平衡中起到至关重要的作用。锌元素含量在肿瘤患者体内发生变化,在肝癌、胆囊癌和前列腺癌等恶性肿瘤患者中,血清和癌组织锌的水平明显降低。在乳腺癌患者,血清锌的含量降低,而癌组织锌的水平明显升高,锌在体内的平衡需要锌转运体的参与,而锌转运体与已知的肿瘤转移相关蛋白金属蛋白酶有相似的结构,提示某种锌转运体可能在乳腺癌的发生发展过程中起作用。有研究报道,锌转运体ZIP10的表达水平与临床乳腺癌的恶性程度和转移能力呈正相关；而且在侵袭和转移能力较大的MDA-MB-231细胞中的表达明显高于转移能力相对较低的MCF-7细胞,ZIP1O可能与乳腺癌细胞的侵袭能力有关。二、研究目的构建ZIP10基因表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7细胞,研究ZIP10过表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。三、实验方法首先构建ZIP10基因表达载体pEGFP-N1-ZIP10,经双酶切后凝胶电泳及测序鉴定,利用脂质体转染法将pEGFP-N1-ZIP10及其相应空载体分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231(ER-)及MCF-7(ER+)。48h后,用荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达,RT-PCR和Western-blot技术分别检测乳腺癌细胞中ZIP10 mRNA和蛋白质的表达水平,然后采用RT-PCR技术检测乳腺癌细胞中锌转运体家族其他成员ZnT1、ZIP10、ZIP6以及肿瘤侵袭转移相关基因CD44、MMP2等表达变化,细胞增殖实验(MTT)检测转染pEGFP-N1-ZIP10前后乳腺癌细胞增殖活性变化,并采用肿瘤侵袭实验(Transwell)分析转染pEGFP-N1-ZIP10前后乳腺癌细胞侵袭能力的改变。四、实验结果ZIP10基因表达载体pEGFP-Nl-ZIP10经双酶切凝胶电泳及测序完全正确；荧光显微镜观察,转染48h后GFP表达阳性细胞约为60%；RT-PCR、Western-blot结果显示,ZIP10表达载体转染MCF-7和MDA-MB-231细胞,并在细胞表达；ZIP10过表达显著抑制锌转运体ZIP1的表达水平,而对锌转运体ZnT1、ZIP6的表达没有显著影响；MTT细胞增殖实验显示,pEGFP-Nl-ZIPIO转染乳腺癌细胞后对其增殖活性没有明显影响；Transwell肿瘤侵袭实验显示,ZIP10过表达可显著增加乳腺癌细胞的侵袭能力。五、实验结论我们成功构建了ZIP10表达载体,并在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中表达,ZIP10抑制同一家族锌转运体ZIP1的表达,对细胞增殖活性没有明显影响,显著增加乳腺癌细胞的侵袭能力。锌转运体ZIP10与乳腺癌细胞侵袭能力相关。