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本试验对山羊乳腺组织细胞的分离及原代培养方法进行了改进,并对乳腺上皮细胞的一些生长特性作了总结;在此基础上,以7,12-二甲基苯蒽(DMBA)为致癌剂,佛波酯(TPA)为促癌剂,探索了乳腺上皮细胞体外两步法转化的过程,摸索了改良Feulgen染色的程序,为进一步利用ICM(显微图像分析仪)对转化过程中核DNA 含量的变化进行实时监测奠定基础,结果如下: 1. 用组织块培养法和消化法均可获得良好的山羊乳腺细胞原代培养物;培养的山羊乳腺成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感,混合培养物用0.15%胰蛋白酶与0.02% EDTA 消化液在37℃控时消化,先脱落下来的主要为成纤维细胞,经过2~3 代传代筛选培养,即可得到纯化的乳腺上皮细胞。2. 用添加10% DMSO 和10%胎牛血清的DMEM/F12 为冻存液,按直径不同将山羊乳腺组织块分成3 组:小于0.3 mm,0.3~0.5 mm 和0.5~1.0 mm,并适当延长体外平衡时间进行冷冻保存。结果表明:以直径<0.3 mm,每管不超过6 块为佳,采用室温平衡6 h 后分两次梯度添加DMSO 至10%,于0 ℃平衡1 h,-20 ℃平衡2 h,直接投入到液氮中的冻存效果较好。3. 用DMEM/F12 体外培养山羊乳腺上皮细胞,传至第9 代时其生长仍正常。多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对细胞上清液中的蛋白质进行分离,其中有3 个条带与标准蛋白的3个条带一致,表明山羊乳腺上皮细胞在体外培养条件下能表达山羊酪蛋白。4. 以含5 ug/mL、10 ug/mL、15 ug/mL DMBA 的完全培养液对组织块和消化法得到的细胞分别进行36 h,24 h和12 h处理后,施以25 ng/mL TPA作用2 周,结果显示,15 ug/mL DMBA 作用12 h组细胞基本死亡,5 ug/mL DMBA 36 h组细胞转化效果最佳;转化细胞的初期形态学表现为:细胞增大,扁平;随后细胞核浓缩,细胞整体变小;接着细胞排列紊乱,出现无规则生长;最后出现转化灶。5. 应用改良Feulgen染色法定量监测转化过程中细胞核DNA 的变化,以95%乙醇固定15 min,8mol/mL 盐酸水解10 min,Schiff 液作用20 min,其染色效果较佳;对培养在塑料皿中的单层细胞直接染色时,最后的二甲苯透明和树胶封片两步要删除,以免影响最终的染色效果。