论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是危害养猪业的重要疫病之一,其病原是猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)。猪小肠是TGEV感染的主要靶器官,猪小肠黏膜上皮细胞是其主要靶细胞。TGEV可引起猪小肠黏膜上皮细胞死亡、脱落,使肠绒毛变短,小肠内水电解质紊乱,肠内渗透压升高,导致仔猪发生严重的腹泻、脱水、代谢性酸中毒,死亡率高,给养猪业造成巨大的损失。研究发现,TGEV引起的细胞线粒体损伤是造成细胞死亡的关键环节,而细胞线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)是线粒体损伤的开关,mPTP异常开放可引起线粒体损伤,释放凋亡因子并激活凋亡信号通路,诱导细胞死亡的发生。病毒感染宿主细胞后可以引起circRNA的差异表达,且差异表达的circRNA在病毒感染中发挥着重要的调节作用。前期研究发现,TGEV感染猪小肠黏膜上皮细胞(porcine intestinal epithelial cell jejunum 2,IPEC-J2)引起线粒体损伤过程中circRNA表达谱发生变化,circRNA在mPTP开放过程中发挥了重要作用。然而,TGEV感染对IPEC-J2细胞mPTP的开放作用和差异表达circRNA在此过程中的作用及机制尚不清楚。本研究首先探索了TGEV感染IPEC-J2细胞后mPTP的开放程度及其关键调控因子表达的变化,然后筛选、鉴定了TGEV感染IPEC-J2细胞后差异表达的circRNA,进一步研究了差异表达的circRNA在mPTP开放过程中的作用及机制,最后明确了TGEV调控circRNA差异表达的机制。研究取得以下结果。1.TGEV感染对细胞mPTP及其关键调控因子的影响研究。1 MOI TGEV感染IPEC-J2细胞12 h后mPTP检测结果显示,TGEV感染IPEC-J2细胞后引起线粒体钙离子浓度极显著升高(P<0.01)、MMP极显著下降(P<0.01)和mPTP异常开放(P<0.01)。q RT-PCR、western blotting结果显示,TGEV感染IPEC-J2细胞和仔猪空肠组织后mPTP关键调控因子VDAC1、Cyp D、ANT1及ATP5D在m RNA和蛋白水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。2.TGEV感染IPEC-J2细胞后circRNA的鉴定及其在细胞mPTP异常开放中的作用。qRT-PCR筛选与线粒体相关的差异表达circRNA,将筛选结果中表达量最高且变化极显著的circ5884作为研究对象,并在NCBI上与猪的基因组序列比对发现,circ5884由birc6基因的外显子63、外显子64、外显子65和外显子66拼接而成,根据其亲本基因命名为circBIRC6-2。PCR、RNase R消化及FISH鉴定circBIRC6-2为环状RNA。q RT-PCR和FISH结果显示,circBIRC6-2定位于细胞质和细胞核中,且在TGEV感染IPEC-J2细胞和仔猪空肠组织后均极显著下调(P<0.01)。过表达和干扰circBIRC6-2后检测细胞mPTP开放程度,结果显示,circBIRC6-2可极显著抑制线粒体钙离子浓度升高(P<0.01)、极显著抑制MMP下降(P<0.01)和极显著抑制mPTP异常开放(P<0.01)。3.circBIRC6-2调控mPTP异常开放作用方式研究。qRT-PCR结果显示,circBIRC6-2不影响亲本基因birc6的转录(P>0.05)。RIP结果表明,VDAC1、Cyp D、ANT1及ATP5D不与circBIRC6-2直接互作(P>0.05)。对circBIRC6-2编码序列进行分析发现,circBIRC6-2含有1个可编码236个氨基酸的ORF和2个潜在的IRES序列。DLR结果显示,2个IRES序列均可极显著促进蛋白的翻译(P<0.01)。为了验证circBIRC6-2是否编码蛋白,构建了pcircBIRC6-2、pcircBIRC6-2-Flag、pcircBIRC6-2-Flag-Mut和p Flag-BIRC6-236aa重组质粒,分别包装成慢病毒并感染IPEC-J2细胞,q RT-PCR、western blotting、IP-MS、IF和IEM结果显示,circBIRC6-2可编码长为236个氨基酸的蛋白,并将其命名为BIRC6-236aa,该蛋白定位于细胞质、细胞核和线粒体中。进一步发现,circBIRC6-2可通过编码蛋白BIRC6-236aa极显著抑制线粒体钙离子浓度的升高(P<0.01)、极显著抑制MMP下降(P<0.01)和显著抑制mPTP异常开放(P<0.05)。4.BIRC6-236aa靶向VDAC1调控TGEV诱导的mPTP异常开放的机制。过表达BIRC6-236aa,IP-MS结果显示,细胞中有91个蛋白可能与BIRC6-236aa互作。生物信息学分析发现,BIRC6-236aa互作蛋白可富集在线粒体相关生物学过程,且有16个蛋白定位于线粒体。Co-IP和PLA结果显示,BIRC6-236aa可与VDAC1互作。进一步研究发现,circBIRC6-2和BIRC6-236aa均可显著降低VDAC1和Cyp D之间的互作(P<0.05或P<0.01)。5.TGEV调控circBIRC6-2表达的机制。分别过表达TGEV结构蛋白和非结构蛋白,qRT-PCR结果显示,TGEV-M可极显著抑制circBIRC6-2的表达(P<0.01)。IP-MS结果显示,细胞中有117个蛋白与TGEV-M互作。Co-IP和PLA结果显示,TGEV-M可以与hn RNPA1在细胞质中互作,TGEV可阻止hnRNPA1入核。qRT-PCR结果显示,hnRNPA1可极显著促进circBIRC6-2的表达(P<0.01)。RIP结果显示,hn RNPA1与birc6的pre-m RNA结合。进一步研究发现,TGEV-M可极显著促进线粒体钙离子浓度的升高(P<0.01)、极显著促进MMP下降(P<0.01)和显著促进mPTP异常开放(P<0.05),且TGEV-M可显著促进VDAC1和Cyp D的互作(P<0.05)。本研究发现TGEV可诱导IPEC-J2细胞mPTP异常开放,circBIRC6-2可通过编码蛋白BIRC6-236aa抑制VDAC1和Cyp D蛋白复合物的形成,进而抑制TGEV诱导的mPTP异常开放,TGEV-M可通过与hn RNPA1互作抑制circBIRC6-2产生。本研究阐明了TGEV引起mPTP异常开放及circBIRC6-2在此过程中的作用及机制,为进一步揭示TGEV致病机制提供理论依据。