研究背景：人巨细胞病毒(HCMV)属疱疹病毒,有脂质包膜,229kb的双链DNA,通过直接接触传播。HCMV感染常见于宫内、婴幼儿、器官移植、骨髓移植、免疫抑制或缺陷和艾滋病患者,在免疫力正常人群中也有造成致死感染的报道。由于HCMV产生的病毒因子能使其能逃逸宿主免疫,侵入靶细胞后造成产毒型、潜伏型、细胞转化和不全感染。目前治疗HCMV感染的药物都是在HCMV进入靶细胞后才发挥作用,无法彻底清除病毒。目前缺乏针对HCMV侵入靶细胞前,即在与靶细胞膜黏附、结合或融合等环节起阻断作用的药物。本研究纯化天然MBL(hMBL),研制和纯化重组人野生型MBL(rhMBL),从人外周血单个核细胞衍生出DC (monocyte-derived dendritic cell, MD-DC);研究hMBL/rrhMBL阻遏HCMV感染MD-DC,和阻遏MD-DC将捕获的HCMV呈递给T细胞的功能,并初步探讨其机制。为明确MBL阻断HCMV感染的作用和机制,为MBL应用于HCMV感染的治疗与预防奠定基础。材料与方法1.建立rhMBL的CHO细胞株构建rhMBL的PIRES2-AcGFP表达载体,参照Ohtani et al方法并加以改进。用上述载体转染中国仓鼠卵巢细胞株(Chinese hamster ovary cells, CHO),按Transfast说明书配制转染试剂并进行转染培养的CHO细胞,用G418筛选抗性细胞即稳定转染的细胞,RT-PCR分析稳定转染细胞株MBL基因的表达,ELISA检测MBL蛋白。2.hMBL/rhMBL的获得、纯化、鉴定和定量CHO/MBL细胞在含20%小牛血清的MEDM培养液中,37℃,5%CO2及饱和湿度条件下培养。取培养上清和人新鲜血浆进行甘露聚糖-Sepharose 4B亲和层析纯化。SDS-PAGE鉴定纯度,考马斯量蓝进行蛋白定量。3. MD-DC和T细胞培养通过淋巴细胞分离液分离浓缩外周血单个核细胞,贴壁2小时后除去未贴壁的细胞。在rhGM-CSF(终浓度20 ng/ml)和rhIL-4(终浓度10ngIU/ml)含10%小牛血清的RPMI1640中培养。第3天半量换液,收集培养6天处于未成熟状态的MD-DC,参考Svane IM报道方法,经倒置相差显微镜观察形态和流式检测DC-SIGN分子表达率；5μg/ml植物凝集素A(PHA)刺激人外周血单个核细胞,衍生为人活化T细胞。4.免疫荧光共聚焦显微镜观察MBL阻滞MD-DC捕获HCMV功能用PKH26(红色荧光)标记HCMV,洗涤4次除去未结合的PKH26,取2×107 (DNA拷贝数)染色后的HCMV感染与MBL孵育半小时后的5×105MD-DC,反应终体积为1ml, PBS洗涤4次除去未结合的HCMV,用CD209-FITC(绿色)标记MD-DC表面DC-SIGN分子。对照组的MD-DC未经MBL孵育。离心取沉淀做成载薄片。采用免疫荧光共聚焦显微镜观察MBL处理前后DC-SIGN对HCMV的捕获情况,并拍照。5. MBL阻遏MD-DC捕获HCMV功能在48孔板中,每试验孔加5×105MD-DC,分别加hMBL/rhMBL到终浓度1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,加完全培养基在37℃,5%CO2孵箱中孵育半小时。每试验孔加2×107(DNA拷贝数)HCMV,反应终体积为1ml,孵育2小时后PBS洗涤4次,彻底除去未与MD-DC结合的HCMV。荧光定量PCR检测MD-DC捕获HCMV的DNA拷贝数。试验分7组,分别为对照组“MD-DC+HCMV”,实验组“MD-DC+hMBL(1μg)+ HCMV”组、“MD-DC+hMBL(5μg)+HCMV”组、“MD-DC+hMBL(10μg)+ HCMV”组、“MD-DC+rhMBL(1μg/ml)+HCMV’’组、‘“MD-DC+rhMBL(5μg/ml) +HCMV’’组和“MD-DC+rhMBL(10μg/ml)+HCMV”组。6. MD-DC呈递HCMV给T细胞的功能在48孔板中,取MD-DC(2.5×105)加入HCMV(2×107DNA拷贝数),孵育半小时后,4次PBS冲洗,除去未结合的HCMV,与加入PHA刺激活化后的2.5×105T细胞,用完全培养基在37℃,5%CO2孵箱中培养,分别于第3天、4天取培养上清用RT-PCR检测HCMV的DNA的量,每孔做5个复孔,每孔终体积为1ml,对照组不加T细胞。7. MBL阻遏MD-DC呈递HCMV给T细胞的功能在48孔板中,经方法5处理的MD-DC(2.5×105)与加入PHA刺激活化后的2.5×105T细胞,用完全培养基在37℃,5%CO2孵箱中培养,分别于第3天、4天取上清用RT-PCR检测HCMV的DNA的量,每孔做5个复孔,每孔终体积为1ml,对照组不加MBL。8.采用CD4+免疫磁株分选法分离出CD4+T细胞,按试剂盒操作说明进行。9.CD209单抗和CD206单抗阻滞MD-DC呈递HCMV功能试验取新收获的克隆增长的MD-DC和PHA刺激活化的T细胞,在含10%胎牛血清RPMI1640培养液中,37℃,5%CO2及饱和湿度条件下培养,取存活率达95%以上的细胞用于实验。试验在48孔板中进行,取MD-DC(2.5×108／每孔)分别与未被荧光标记的10μg CD209单抗和10μg CD206单抗[抗甘露聚糖受体(mannan receptor MR)抗体]在37℃孵育15分钟。加入HCMV(2×107DNA拷贝数／每孔),37℃孵育2小时后,4次PBS冲洗,除去未结合的HCMV,与PHA刺激活化后的2.5×105T细胞,用完全培养基在37℃,5%CO2孵箱中共同培养,每孔终体积为1ml,每组做5个复孔,对照组不加抗体。试验分以下3组：(1)HCMV组(对照组)：MD-DC+HCMV+T细胞(2)CD206组：MD-DC+CD206+HCMV+T细胞(3)CD209组：MD-DC+CD209+HCMV+T细胞分别于第3天、4天取培养上清用RT-PCR检测HCMV的DNA的量；培养上清中HCMV DNA量的百分数(%)=培养上清中HCMV DNA量／初始加入的HCMV DNA量(2×107)×100。10.PP65+GAM-FITC单色流式细胞术检测细胞内HCMV-PP65的量,参照试剂盒说明书进行。11.统计学处理全部数据采用SPSS 13.0统计软件处理。数据以均值±标准差(X±SD)表示,采用单向方差分析,P≤0.05有显著统计学意义。结果：1.通过RT-Q-PCR技术检测稳转细胞目的基因表达效果基因的表达量F=2的—△△ct次方△△ct=(待测样品的目的基因的ct的平均—待测样本的看家基因的ct的平均)—(对照样品的目的基因的ct的平均—对照样本的看家基因的ct的平均),备注：2-△△ct值越大,说明该基因的表达量越高；3.5引物F (bp514):5’-GGAGCCATTCAGAATCTCATCA-3’R (bp652C):5’-AACCAGCATTGTTGGGTTCA-3’筛选得到2种稳定细胞株,在转染野生型表达质粒的细胞株中目的基因表达是转染空载体细胞株的103倍以上。2.获得大量高纯度的hMBL/rhMBL从200ml人血浆中纯化出320mg高纯度的MBL,在1000ml的CHO/MBL培养上清中,能纯化到510mg,经SDS-PAGE鉴定,经SDS还原后的MBL单体的分子量为26KD,MBL经SDS还原成单体跑胶未见明显的杂蛋白条带,提示纯度高。3. MD-DC和活化T细胞的培养外周血单个核细胞GM-CSF和IL-4刺激后,第6天用倒置相差显微镜观察细胞形态：可见细胞集落样生长,折光性强,细胞不规则,有伪足。用CD209-FITC单色流式细胞仪检测MD-DC百分数稳定表达在85%以上。4.免疫荧光共聚焦显微镜观察MBL阻滞MD-DC捕获MCV的功能MD-DC捕获了经PKH26(红色荧光)标记的HCMV感染后,用CD209-FITC(绿色)标记NID-DC表面的DC-SIGN分子,然后采用免疫荧光共聚焦显微镜观察MBL处理前后DC-SIGN对HCMV的捕获情况。可见未经MBL孵育的MD-DC捕获HCMV的量较多,而经hMBL和rhMBL孵育后的MD-DC捕获的HCMV的量明显减少。表明10μg/ml浓度的hMBL/rhMBL具有明显的阻遏作用。5.hMBL/rhMBL阻遏MD-DC捕获HCMV功能为探索MBL阻遏MD-DC捕获HCMV的功能,MD-DC暴露于不同浓度和不同类型的MBL孵育半小时后,再与HCMV37℃孵育2小时后,MD-DC经4次PBS洗涤彻底除去未被捕获的HCMV,荧光定量PCR检测MD-DC内的HCMVDNA的拷贝数。这代表了被MD-DC捕获的HCMV DNA的量。与初始加入的HCMV DNA量为对照,捕获的HCMV DNA量的百分数(%)=捕获的HCMVDNA量／初始加入的HCMV DNA量×100。与未经MBL孵育过的MD-DC所捕获的HCMV DNA量对照,捕获的HCMV DNA量的百分数(%)=MBL孵育后MD-DC捕获的HCMV DNA量／未经MBL孵育的MD-DC捕获的HCMV DNA量×100。经统计分析,与不加MBL的组对照,1μg/ml的hMBL组和1μg/ml rhMBL组均没有显著意义(P=0.207,95%CI:-0.0935-0.4135;P=0.117,95%CI:-0.0535-0.4535),而5μg/ml和10μg/ml的hMBL组,5μg/ml和10μg/ml rhMBL组与对照组相比均具有显著的差异(P=0.005,95%CI:0.1265-0.6335;P= 0.003, 95%CI:0.1465-0.6535; P=0.015,95%CI:0.0665-0.5735;P=0.007,95%CI:0.1065-0.6135)。随着MBL剂量从1μg/ml增加到10μg/ml,MD-DC捕获CMV的DNA量百分数均值有下降趋势,但统计学分析,组间均没有统计学差异(P>0.05)。与未经MBL孵育的MD-DC的捕获功能相对照,hMBL和rhMBL阻遏MD-DC捕获CMV DNA量(2×107／ml)百分数的IC 50分别为4.5μg/ml和7.4μg/ml。6. MD-DC呈递HCMV给T细胞的功能因为MD-DC能捕获和传递HCMV给允许细胞,我们想探明DC-SIGN能否将低敏感的T细胞变得对HCMV易感。培养上清中的HCMV DNA量的百分数(%)=培养上清中HCMV DNA量/初始加入的HCMV DNA量(2×107)×100。结果表明,第3天和第4天试验组“MD-DC+HCMV+T”组培养上清中HCMV DNA的量较对照组“MD-DC+HCMV”组明显升高,有统计学意义(F=46.398, P=0.000; F=16.702, P=0.004)。提示有大量的HCMV在T细胞内增值复制。7. hMBL/rhMBL阻遏MD-DC的HCMV传递功能因为MD-DC能捕获和传递HCMV给T细胞,我们想探明MBL能否阻遏HCMV从MD-DC传递给T细胞。与不加MBL的组相对照,共培养第3天,hMBL/rhMBL的阻遏MD-DC的HCMV传递功能IC50分别为4.7μg/ml和3.1μg/ml:共培养第4天,hMBL/rhMBL的阻遏MD-DC的HCMV传递功能IC50分别为4.6μg/ml和2.1μg/ml。证实hMBL/rhMBL孵育后的MD-DC呈递HCMV DNA的量显著下降,并具有剂量依赖的阻遏作用。不同剂量的hMBL/rhMBL阻遏MD-DC的HCMV传递结果,经统计分析,各试验组分别在第3天和第4天,与不加MBL的组对照,1μg/ml rhMBL组均没有显著意义(P=0.220,95%CI:-5.2627-1.2627;P=0.199,95%CI:-1.5327-7.0527); 1μg/ml,5μg/ml和10μg/ml的hMBL组和5μg/ml和10μg/ml的rhMBL组与对照组相比,均具有显著性差异(P<0.005),而5μg/ml和10μg/ml的hMBL组间没有统计学差异(P=0.085,95%CI:-0.4227-6.1027;P=0.236,95%CI:-1.7527-6.8327), 5μg/ml和10μg/ml的rhMBL组间也没有统计学差异(P=0.211,95%CI:-5.3027-1.2227; P=0.857,95%CI:-3.9127-4.6727).在共培养第4天,同组的5个孔MD-DC和T细胞被收集到1管,共7管,经免疫磁株阳性分选法分选出CD4+T细胞,CD3-APC单色流式细胞术检测分选前后T细胞的百分数从48％～55%上升到93%～99%;PP65-GAM-FITC流式细胞术检测T细胞内各组HCMV PP65蛋白量从35.4%～%17.9不等,和荧光定量PCR法检测T细胞内各组HCMV DNA的量从28×103／ml-5.9×103／ml不等。表明MD-DC确实将其捕获的HCMV传递给T细胞,并且HCMV在T细胞内能增值。结论：1.成功建立分泌rhMBL细胞株(CHO/rhMBL),获得高纯度的rhMBL和hMBL;2.成功从人外周血单个核细胞衍生出高表达DC-SIGN的MD-DC;3.MD-DC具有捕获HCMV并将其呈递给T细胞的功能；4.rhMB和LhMBL均能阻遏MD-DC对HCMV的捕获和呈递功能,但rhMBL效果较hMBL略差；5.MD-DC捕获HCMV并将其呈递给T细胞的功能是通过DC-SIGN分子实现的。