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目的:遗传性痉挛性截瘫(HSP)是由SPAST基因突变引起的常染色体显性遗传性疾病,主要表现为双下肢进行性痉挛。但是已有报道部分患者可伴有认知功能障碍,而认知功能与树突棘上AMPA受体的表达密切相关。因此,本文探讨了spastin磷酸化修饰是否调控α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体GluA2亚基的膜表达介导树突棘可塑性。方法:1.用质谱分析技术鉴定spastin的磷酸化位点,构建spastin四个磷酸化位点(S210,S233,T271,S562)全部和分别点突变的模拟磷酸化和去磷酸化质粒。2.培养原代海马神经元,用钙磷转染的方法在神经元中将目的基因过表达。通过免疫细胞化学实验观察树突棘形态发育和膜表面AMPA受体GluA2亚基表达,全细胞膜片钳记录m EPSC,统计振幅和频率。3.在COS1细胞中过表达spastin及其磷酸化突变的质粒,通过免疫细胞化学实验明确其对微管切割活性的影响。4.通过GST Pull-down,Co-IP和共定位实验,研究spastin和GluA2在体内外的相互作用。结果:1.磷酸化spastin促进培养的原代海马神经元树突棘成熟和AMPA受体GluA2亚基的膜表达。免疫细胞化学结果显示:与对照组相比,spastin(Qm D)使培养的海马神经元成熟的树突棘增多(P<0.05),spastin(Qm A)使不成熟的树突棘增多(P<0.05);过表达spastin(Qm D)使培养的海马神经元膜表面GluA2相对荧光强度增强(P<0.05),spastin(Qm A)使膜表面GluA2相对荧光强度减弱(P<0.05)。全细胞膜片钳记录m EPSC结果显示:与对照组相比,spastin(Qm D)促进m EPSC振幅和频率增加(P<0.05),spastin(Qm A)使m EPSC振幅和频率减少(P<0.05)。2.Spastin与AMPA受体GluA2亚基存在相互作用,这种结合在spastin磷酸化时增强。GST Pull-down和Co-IP结果提示:spastin和GluA2在体外和体内均存在直接相互作用,与野生型spastin相比,spastin(Qm D)与GluA2结合增强,spastin(Qm A)与GluA2结合减弱。3.Spastin去磷酸化增强微切割活性,免疫细胞化学结果显示:与对照组相比,spastin及其磷酸化突变均减弱COS1细胞微管的相对荧光强度(P<0.05);与spastin相比,spastin(Qm A)组的微管的相对荧光强度更弱(P<0.05)。4.Spastin 210位点的磷酸化促进稳定表达GluA2的HEK293细胞株膜表面GluA2的表达并且使神经元m EPSC振幅和频率均增加。免疫细胞化学结果显示:与对照组相比,spastin(Qm D)和spastin(S210D)使稳定表达GluA2的HEK293细胞的膜表面GluA2相对荧光强度增强(P<0.05),spastin(Qm A)和spastin(S210A)使膜表面GluA2相对荧光强度减弱(P<0.05)。全细胞膜片钳记录m EPSC结果显示:与对照组相比,spastin(S210D)促进m EPSC振幅和频率增加(P<0.05),spastin(S210A)使m EPSC振幅和频率减少(P<0.05)。5.突变spastin 353位点抑制微管切割活性同时突变210位点使其模拟磷酸化,可以促进培养的原代海马神经元AMPA受体GluA2亚基的表达。免疫细胞化学结果显示:与对照组相比,spastin减弱COS1细胞微管的相对荧光强度(P<0.05),spastin(K353A)和spastin(R464C)与对照组无明显差异(P>0.05)。与对照组相比,spastin(K353A,S210D)使培养的海马神经元膜表面GluA2相对荧光强度增强(P<0.05),spastin(K353A,S210A)使膜表面GluA2相对荧光强度减弱(P<0.05)。全细胞膜片钳记录m EPSC结果显示:与对照组相比,spastin(K353A,S210D)促进m EPSC振幅和频率增加(P<0.05),spastin(K353A,S210A)使m EPSC振幅和频率减少(P<0.05)。结论;1.磷酸化的Spastin通过促进AMPA受体GluA2亚基的膜表达促进树突棘成熟。2.Spastin与GluA2亚基存在相互作用,该作用在spastin磷酸化时增强,去磷酸化时减弱。3.Spastin S210位点磷酸化促进AMPA受体GluA2亚基的膜表达,并且这种作用不依赖于微管动力。