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家蚕(Bombyx mori)作为一种具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,面临着严重的疾病威胁。家蚕质型多角体病毒(B.mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是蚕业生产中常见的、危害十分严重的病原之一,引起家蚕中肠型脓病,降低蚕茧产量及茧丝质量,最终给蚕业生产带来极大的经济损失。本实验室前期对感染BmCPV的家蚕cDNA模板进行转录组测序分析,在中肠筛选出多个抗性候选基因,其中包括家蚕肽聚糖识别蛋白S2(B.mori peptidoglycan recognition protein S2,BmPGRP-S2)和家蚕丝氨酸羧肽酶1(B.mori serine carboxypeptidase 1,BmSCP1)。在昆虫的先天免疫防御中,PGRPs作为模式识别受体能激活Toll和Imd信号通路诱导下游抗菌肽基因的表达去帮助宿主抵抗外来微生物的入侵。中肠是家蚕重要的免疫器官,能够分泌一些具有抗病毒活性的蛋白到肠液中,在感染初期抑制病毒的入侵。本论文将对BmPGRP-S2和BmSCP1的功能进行初步研究,并制备抗BmCPV转基因家蚕素材,分别在调控宿主先天免疫防御和病毒感染初期抑制BmCPV的增殖。主要获得以下的研究结果:1.增量表达BmPGRP-S2激活免疫通路提高家蚕对BmCPV的抗性基于基因组生物信息学和芯片数据分析,本研究从家蚕中肠中克隆得到BmPGRP-S2基因,多序列比对分析结果表明BmPGRP-S2蛋白不具备酰胺酶活性。构建BmPGRP-S2增量表达载体,瞬时转染BmE细胞,qPCR结果表明,增量表达BmPGRP-S2不会激活Toll和Imd信号通路。构建BmPGRP-S2转基因增量表达载体pb-PGRPS2,通过胚胎显微注射获得两个转基因品系PGRPS2-1和PGRPS2-2。qPCR和western blot结果显示,BmPGRP-S2增量表达成功,且被分泌到细胞外。抗性检测结果显示,当四龄起蚕以3×10~5个/头经口食下感染BmCPV后,PGRPS2-1、PGRPS2-2和对照死亡率分别为12%、16%和48%,PGRPS2-1和PGRPS2-2的死亡率分别比对照降低了36%和32%。qPCR检测感染后72 h家蚕体内病毒含量,结果表明,转基因家蚕体内的BmCPV含量显著低于对照。主要经济性状调查结果显示,PGRPS2-1、PGRPS2-2和对照之间的全茧量和茧层率均没有明显区别。对未感染病毒家蚕的Toll和Imd通路基因进行qPCR检测,结果显示,与对照相比,PGRPS2-1中Toll和Imd通路基因均未发生显著变化。感染病毒后,与对照相比,PGRPS2-1中Imd通路基因imd和relish被诱导上调表达,抗菌肽基因attacin2、gloverin2以及moricin基因的表达量升高,而Toll通路基因表达量无显著变化。这些结果表明增量表达BmPGRP-S2可以通过激活Imd通路诱导抗菌肽基因升高,有效提高家蚕的抗BmCPV能力,同时不会影响家蚕的经济性状。2.增量表达BmSCP1在感染初期抑制BmCPV提高家蚕抗性基于基因组生物信息学和芯片数据分析,本研究从家蚕中肠中克隆得到BmSCP1基因,多序列比对分析发现BmSCP1具有丝氨酸蛋白酶的催化中心,认为其是一个丝氨酸蛋白酶。构建BmSCP1增量表达载体,瞬时转染BmE细胞后,RT-PCR和western blot检测结果表明,BmSCP1属于分泌蛋白。而后,利用原核表达载体成功制备BmSCP1多克隆抗体。构建BmSCP1转基因增量表达载体pb-SCP1,通过胚胎显微注射获得两个转基因品系SCP1-1和SCP1-2。qPCR和western blot结果显示,BmSCP1在转基因家蚕中肠显著升高,且转基因家蚕肠液中BmSCP1含量明显高于对照。抗性检测结果显示,当四龄起蚕以3×10~5个/头经口食下感染BmCPV后,SCP1-1、SCP1-2和对照死亡率分别为22%、27%和45%,SCP1-1和SCP1-2的死亡率分别比对照降低了23%和18%。qPCR检测感染后72 h家蚕体内病毒含量,结果表明,转基因家蚕体内的BmCPV含量显著低于对照。全茧量和茧层率调查结果显示,表明增量表达BmSCP1不会影响家蚕的主要经济性状。经肠液处理后的病毒,最终以13×10~5个/头的病毒浓度添食四龄起蚕,qPCR检测感染后24 h家蚕体内病毒含量,结果显示,经转基因肠液处理后的病毒在家蚕体内含量比对照更低,而用BmSCP抗体处理后的肠液使病毒在家蚕体内含量比对照更高。这些结果表明,BmSCP1能够在感染初期(肠液中)抑制病毒。