人胚胎干细胞（Human embryonic stem cells,hESCs）可在体外分化为心肌细胞,在心脏发育和疾病研究、细胞治疗、药物筛选和毒性分析等方面具有巨大的应用潜力。目前的心肌细胞诱导方法仍存在效率低、稳定性差和异质性高等问题,限制了干细胞衍生心肌细胞的临床研究和转化。MicroRNAs（miRNAs）是一类长约22个碱基的非编码RNAs,能够特异性结合靶mRNA,并直接降解mRNA或者抑制蛋白质翻译,在心脏发育和心肌分化过程中发挥重要作用。本研究发现MIR148A家族成员MIR148A、MIR148B和MIR152的表达水平在hESCs向心肌细胞分化进程中显著升高。为探索MIR148A家族在心肌分化中的功能,本研究利用 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9）基因组编辑技术分别建立了 MIR148A家族三个成员的单敲除hESCs系和全敲除hESCs系（MIR148A-TKO）。研究显示,三个MIR148A家族成员单敲除并不影响hESCs的心肌分化效率,且单敲除hESCs系中的MIR148A家族成员间具有剂量补偿作用。MIR148A-TKO细胞具有与野生型hESCs相似的自我更新和三胚层分化能力。与野生型hESCs相比,MIR148A-TKO细胞的心肌细胞分化效率显著降低;而过表达MIR152显著提高MIR148A-TKO细胞和野生型hESCs的心肌分化效率。本研究利用实时定量PCR方法进一步证实,MIR148A家族成员全敲除并不影响原条形成相关基因（T、MIXL1）的表达水平,但显著抑制侧板中胚层标志分子（MESP1、FOXF1）及随后心肌前体细胞标志分子（ISL1、NKX2.5）的表达。通过对心肌分化第4天（侧板中胚层时期）样本进行高通量转录组分析（RNA-Seq）,本研究筛选到1837个在MIR148A-TKO和hESCs衍生细胞中差异表达的基因。功能聚类分析表明,在MIR148A-TKO分化细胞中上调的基因主要为轴旁中胚层及体节发育相关基因,而下调的基因主要为侧板中胚层和心肌发育相关基因。信号通路聚类分析显示,NOTCH信号通路相关基因在MIR148A-TKO衍生细胞中显著富集。TargetScan预测和荧光素酶活性分析进一步证实NOTCH信号通路的配体DLL1是MIR148A家族的直接靶基因。shRNA介导的DLL1干涉可显著抑制MIR148A-TKO衍生细胞中NOTCH信号下游基因的表达,提高MIR148A-TKO细胞的心肌分化效率。结论:MIR148A家族成员在hESCs心肌分化过程中表达水平显著上调,MIR148A家族成员全部敲除不影响hESCs本身的自我更新和分化能力,但显著降低心肌细胞分化效率。在心肌分化过程中,MIR148A家族成员可通过抑制DLL1-NOTCH信号通路来维持hESCs向侧板中胚层和心肌前体细胞分化进程;MIR148A家族成员全敲除将解除其对DLL1-NOTCH信号通路的抑制作用,进而促进多能干细胞向轴旁中胚层及体节细胞分化,抑制侧板中胚层及心肌细胞的分化。本研究阐明了 MIR148A家族在多能干细胞向心肌细胞分化过程中的功能和调控机制,为研究心肌细胞分化和发育机理,建立和优化心肌细胞分化方法提供了新依据。