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目的:下咽鳞癌化疗效果较差,可能与肿瘤细胞保护性自噬增强导致的耐药有关。本研究通过检测化疗后下咽鳞癌细胞自噬的变化,下咽鳞癌细胞耐药与自噬的相关性及自噬抑制后的下咽鳞癌耐药细胞化疗敏感性及自噬的变化,探讨下咽鳞癌化疗耐药与自噬的相关性,为改善下咽鳞癌化疗耐药问题提供可行的策略及方案。方法:(1)采用免疫组化法检测下咽鳞状细胞癌标本46例(化疗前23例,化疗后23例,化疗前后自身对照)中,自噬相关因子Atg5,LC3II的表达,分析其化疗前后表达变化与化疗,及各临床、病理特征的相关性。(2)采用递增浓度间歇作用法诱导培育耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株,通过CCK-8法检验其耐药,及多药耐药性,并通过Western blotting法,MDC法比较,分析耐药株与常规株中自噬现象的差异。(3)自噬抑制实验:采用Beclin1-si RNA转染耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞,沉默敲低Beclin1基因,并采用RT-PCR法,Western blotting法,筛选出沉默效率最佳的Beclin1-si RNA序列。然后将耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株分为四组,分别为对照组:不加药;顺铂组:加顺铂;顺铂+3-MA组:加顺铂及自噬抑制剂3-MA;顺铂+Beclin1-si RNA组:Beclin1-si RNA沉默敲低Beclin1基因后,再加顺铂组。各组加药后,采用CCK-8法,MDC法,Western blotting法,流式细胞仪法(检测细胞凋亡,细胞周期),检测并比较自噬抑制实验后各组耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞对顺铂敏感性及自噬现象的差异。结果:(1)Atg5,LC3II在下咽鳞状细胞癌组织中化疗后的表达高于化疗前,两者比较,P<0.05,差异有统计学意义。Atg5,LC3II化疗后表达的增加值在不同年龄组(<=60岁,>60岁),N分期组(N0～1,N2～3),T分期组(T1～2,T3～4),临床分期组(III期,IV期),肿瘤细胞病理分化组(高分化,中低分化)中比较,P>0.05,差异均无统计学意义。(2)耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株诱导成功,CCK-8法检测24h,48h,72h时的耐顺铂株IC50分别为36.77u M,28.05u M,17.06u M,高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株的35.21u M,10.92u M,9.560u M。使用顺铂2.5,5,10u M浓度培养细胞,24h,48h,72h后,不同浓度,时间组中,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株的细胞存活率高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株,除2.5u M浓度,24h组P>0.05外,其余组P值均<0.05,差异具有统计学意义。CCK-8法行多药耐药检测中,使用紫杉醇,5-Fu,长春瑞滨后,各浓度,时间组,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株的存活率高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株,部分浓度,时间组P<0.05,具有统计学差异,且与浓度,时间相关,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株显示出一定的多药耐药现象。Western blotting实验中,自噬因子Beclin1,LC3I,LC3II,Atg12-Atg5,p62的表达在耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞株中高于常规下咽鳞癌FaDu细胞株,除LC3-II(P>0.05)外,其余P值均<0.05,具有统计学差异。MDC实验中,耐顺铂下咽鳞癌FaDu细胞中的自噬荧光染色较常规下咽鳞癌FaDu细胞增强。(3)自噬抑制实验:1)Beclin1-si RNA转染后,RT-PCR方法检测细胞中Beclin1m RNA量,发现Beclin1-si RNA-2组Beclin1 m RNA表达量最少,Western blotting法检测发现转染序列Beclin1-si RNA-2组蛋白表达水平最低,显示Beclin1-si RNA-2沉默效率最佳,选取此序列组进行后续细胞实验。2)MDC实验中对照组,顺铂组自噬荧光染色较顺铂+3-MA组,顺铂+Beclin1-si RNA组增强。3)CCK-8法检测顺铂组,顺铂+3-MA组,顺铂+Beclin1-si RNA组24h细胞存活率,顺铂组>顺铂+3-MA组>顺铂+Beclin1-si RNA组,P<0.05,差异具有统计学意义,顺铂+3-MA组与顺铂+Beclin1-si RNA组比较P>0.05,无统计学差异。4)Western blotting实验中Beclin1,LC3I,LC3II,Atg5的表达量,顺铂组>顺铂+3-MA组>顺铂+Beclin1-si RNA组,各组间比较P<0.05,差异具有统计学意义。p62的表达量,顺铂组<顺铂+Beclin1-si RNA组<顺铂+3-MA组,顺铂组与顺铂+3-MA组比较,P值<0.05,差异具有统计学意义,顺铂组与顺铂+Beclin1-si RNA组,顺铂+3-MA组与顺铂+Beclin1-si RNA组,P值均>0.05,差异无统计学差异。5)细胞周期实验中,G1期细胞百分比,对照组(54.10±1.426%)<顺铂组(62.47±0.9188%)<顺铂+3-MA组(67.53±1.106%)<顺铂+Beclin1-si RNA组(73.14±1.931%),各组间比较P值均<0.05,均有统计学差异。S期细胞百分比,对照组(22.38±0.3544%)>顺铂组(20.13±1.801%)>顺铂+3-MA组(19.77±0.7977%)>顺铂+Beclin1-si RNA组(16.75±0.6043%),各组间差异P值部分<0.05。G2期细胞百分比,对照组(23.37±1.027%)>顺铂组(16.99±0.9852%)>顺铂+3-MA组(12.24±1.536%)>顺铂+Beclin1-si RNA组(9.850±1.375%),各组间差异P值均<0.05,均有统计学差异,除顺铂+3-MA组与顺铂+Beclin1-si RNA组,无统计学差异。6)细胞凋亡实验中,各组早期+晚期凋亡+坏死细胞百分比,对照组(4.767±0.4163%)<顺铂组(19.33±1.102%)<顺铂+3-MA组(27.90±0.7810%)<顺铂+Beclin1-si RNA组(34.53±1.464%),各组间差异P值均<0.05,均有统计学差异。结论:1化疗与下咽鳞癌细胞中自噬相关因子Atg5,LC3II的表达增高相关,化疗可诱导下咽鳞癌的自噬增强。而自噬增强与年龄,肿瘤分期,分化,淋巴结转移无相关性。2顺铂可诱导下咽鳞癌FaDu细胞产生耐药及多药耐药现象,且耐药株较常规株自噬增强,提示下咽鳞癌化疗耐药与肿瘤细胞保护性自噬增强具有相关性。3采用自噬抑制剂3-MA及沉默敲低自噬基因Beclin1的表达,可能通过抑制Beclin1-Vps34通路,阻断自噬启始阶段,从而抑制自噬,提高耐药下咽鳞癌FaDu细胞对顺铂的敏感性,说明靶向抑制保护性自噬提高下咽鳞癌对化疗药物的敏感性的策略具有可行性,为进一步改善下咽鳞癌化疗耐药问题提供了理论基础及可行的策略及思路。