目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内具有很高的发病率和死亡率。腹膜转移是晚期胃癌患者发生转移的主要途径,通常会导致大量的腹水或肠梗阻。然而,目前针对于胃癌的腹膜转移,尚未发现具有可靠的诊断和预测预后价值的生物标志物,究其原因,还是对胃癌腹膜转移的机制仍有不明之处。本研究旨在探讨胃癌腹膜转移的机制,并对该过程的关键分子的作用进行深入探讨。研究方法:1.超速离心法提取外泌体。2.电镜和NanoSight鉴定外泌体。3.DID标记外泌体。4.蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测蛋白表达。5.Transwell伤口愈合实验检测细胞迁移侵袭能力。6.肿瘤细胞与腹膜间皮细胞粘附实验检测细胞的粘附能力。7.免疫荧光和免疫组化检测腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells,PMCs)和癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)相关分子的表达。8.采用裸鼠腹膜种植模型进行体内研究。9.小动物PET检测裸鼠腹膜转移结节代谢水平。10.全转录组测序筛选差异表达基因。11.运用生物信息学方法筛选差异表达基因。12.Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验分析LPPR4高低表达组患者的总生存时间的差异。13.应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)评估LPPR4对胃癌腹膜转移诊断的敏感性和特异性。14.应用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测mRNA表达。15.采用si RNA或cDNA质粒转染技术对目的基因进行瞬时沉默或过表达。16.采用慢病毒转染技术建立稳转细胞系,沉默或过表达目的基因。17.京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG)和基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)探讨LPPR4相关信号通路。18.免疫共沉淀方法检测蛋白与蛋白的直接结合能力。19.Spearman相关分析来分析基因之间的相关性。20.统计学分析:采用GraphPad Prism,Social Sciences(SPSS)20.0版和R软件进行统计相关分析。实验数据显示为三次独立重复实验的平均值±标准差(SD)。使用Student’s t检验评估两组数据之间的差异。P<0.05认为具有统计学意义。结果:1.腹膜PMN的形成促进胃癌腹膜转移。通过对胃癌腹膜转移患者腹膜组织进行免疫组化染色结果显示,CAFs相关分子α-SMA显著高表达,而PMCs相关分子Calretinin和WT1则呈现低表达。2.腹膜高转移胃癌细胞系MKN45 P的建立及验证。通过光学显微镜下观察细胞形态变化结果显示MKN45 P细胞相比MKN45细胞形态明显梭形改变。Transwell实验结果表明MKN45 P细胞相比MKN45细胞迁移能力明显增强。通过裸鼠体内实验结果表明MKN45 P较MKN45细胞更能促进裸鼠腹腔转移瘤的形成。3.癌细胞来源exosomes的提取和内化的验证。通过在电镜下观察exosomes的形态发现exosomes呈典型的杯状形态。Nanosight方法检测exosomes的粒子直径结果提示exosomes的直径峰值为96.5 nm。Western blotting方法检测exosomes的特征性标志物结果显示Flotillin-1,CD63,TSG101,CD9在exosomes中的表达均明显高于细胞中的表达。内化实验结果表明DID标记的exosomes被受体细胞HMrSV5细胞有效摄取。4.MKN45 P来源的exosomes促进PMCs的迁移。Transwell实验结果显示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞的迁移能力明显增强,且呈现递增趋势。5.MKN45 P来源的exosomes促进胃癌细胞粘附于PMCs。肿瘤细胞-腹膜间皮细胞粘附实验结果显示相比于PBS对照组,与MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞粘附的胃癌细胞数量显著增多,且呈现递增趋势。6.MKN45 P来源的exosomes促进PMCs向CAFs转化。通过在光学显微镜下观察HMrSV5细胞的形态改变结果显示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞形态发生明显的梭形改变。Western blotting和免疫荧光检测PMCs向CAFs转化过程相关指标结果表明相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes处理后,HMrSV5细胞α-SMA和波形蛋白(Vimentin)明显上调,而WT1和紧密连接蛋白(Zo-1)明显下调。7.MKN45 P分泌的exosomes促进裸鼠腹膜转移瘤形成。通过在裸鼠腹腔内注射MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes或等体积的PBS作为对照进行预处理,然后腹腔注射胃癌细胞MKN45进行裸鼠体内实验。通过小动物PET结果显示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞来源的exosomes预处理后能明显增强腹膜转移瘤的代谢水平。解剖裸鼠后观察到MKN45 P分泌的exosomes更能促进裸鼠腹膜转移瘤形成。8.MKN45 P来源的exosomes促进裸鼠PMCs向CAFs转化。通过取裸鼠腹膜组织进行HE染色观察到PBS对照组腹膜主要由单层连续的腹膜间皮细胞构成,而MKN45和MKN45 P exosomes预处理组的裸鼠腹膜发生明显增厚,呈显著的纤维化改变。通过免疫组化和免疫荧光染色结果提示相比于PBS对照组,MKN45和MKN45 P细胞分泌的exosomes预处理组的裸鼠腹膜组织中PMCs相关分子Calretinin和Mesothelin的表达水平显著下调,而CAFs相关分子α-SMA的表达水平显著上调。9.Exosomal UBE3B是参与腹膜特异性PMN形成的关键性分子。通过将MKN45和MKN45 P细胞进行全转录组测序,对差异表达基因进行KEGG通路富集分析结果发现泛素蛋白酶体通路是重要的差异通路。Western blotting验证实验发现UBE3B可能是其中的关键性分子。10.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B过表达及内化的验证。采用慢病毒在MKN45细胞中过表达UBE3B。内化实验结果证实Exosomal UBE3B被HMrSV5细胞有效摄取,且UBE3B在过表达UBE3B的MKN45细胞来源的exosomes中也呈现过表达。11.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B增强PMCs的迁移能力。Transwell实验结果显示相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞的迁移能力显著增强。12.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B促进胃癌细胞粘附于PMCs。肿瘤细胞-腹膜间皮细胞粘附实验结果显示相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞粘附的胃癌细胞数量显著增多。13.胃癌细胞来源的Exosomal UBE3B促进PMCs向CAFs转化。通过在光学显微镜下观察HMrSV5细胞的形态变化提示相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后的HMrSV5细胞发生了梭形改变。通过Western blotting和免疫荧光结果表明相比于对照组,过表达UBE3B的MKN45细胞分泌的exosomes处理后,HMrSV5细胞α-SMA和Vimentin明显上调,而WT1和Zo-1显著下调。14.生物信息学筛选胃癌不良预后和腹膜转移相关基因。在TCGA-STAD和GSE62254数据集中筛选出胃癌中既具有不良预后价值又与腹膜转移相关的差异表达基因,包括8个基因,LPPR4排名在第二位。15.LPPR4在胃癌腹膜转移患者中高表达并与胃癌患者不良预后相关。通过对GSE62254数据集分析结果提示胃癌腹膜复发组患者LPPR4的表达显著高于无腹膜复发组。通过对TCGA-STAD和GSE62254数据集进行生存分析结果提示LPPR4高表达的胃癌患者的总生存期显著低于LPPR4低表达的胃癌患者。16.LPPR4可作为预测胃癌腹膜转移的生物标志物。通过绘制ROC曲线结果显示LPPR4对胃癌腹膜转移的诊断具有很高的敏感性和特异性。17.LPPR4在胃癌细胞系中表达上调。qRT-PCR和Western blotting检测LPPR4表达水平结果显示相比于胃正常上皮细胞GES-1,LPPR4在胃癌细胞中表达显著上调。根据LPPR4表达水平,采用siRNA在LPPR4高表达的HGC27和MKN74细胞中进行基因沉默,采用过表达质粒在LPPR4低表达的MGC803细胞中进行基因过表达。18.LPPR4促进胃癌细胞迁移侵袭。Transwell和伤口愈合实验结果提示沉默LPPR4后胃癌细胞迁移侵袭能力减弱,反之过表达则增强。19.LPPR4促进胃癌细胞粘附于PMCs。胃癌细胞与PMCs的粘附实验结果表明沉默LPPR4后与PMCs粘附的胃癌细胞减少,反之过表达则增多。20.体内实验证实LPPR4促进胃癌腹膜转移。采用慢病毒在HGC27细胞中敲减LPPR4。通过裸鼠体内实验结果表明沉默LPPR4后裸鼠腹膜转移结节数量及重量明显减少。21.LPPR4与细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)通路相关。通过KEGG和GSEA富集分析结果发现LPPR4高表达与细胞粘附分子通路相关。22.LPPR4参与调节integrinα/FAK信号通路。Western blotting结果提示沉默LPPR4后显著下调了ITGA/FAK通路相关蛋白表达;反之过表达则上调。但是ITGB的表达无明显变化。Spearman相关性分析显示LPPR4与ITGA的表达均呈正相关。23.LPPR4通过Sp1转录因子调控integrinα的表达。免疫共沉淀实验结果显示LPPR4与ITGA之间不存在直接相互作用。通过UCSC基因组网站和JASPAR数据库发现Sp1是ITGA的潜在转录因子。Spearman相关性分析显示LPPR4与Sp1的表达呈正相关,且Sp1与ITGA的表达呈正相关。qRT-PCR和Western blotting结果显示,当敲减LPPR4后,Sp1的表达显著下调。当敲减Sp1后,ITGA的表达也显著下调。24.LPPR4通过调控Sp1促进胃癌细胞的迁移侵袭。Transwell实验提示沉默LPPR4同时过表达Sp1可以逆转LPPR4基因沉默对胃癌细胞的迁移和侵袭能力的抑制。25.LPPR4通过调控Sp1促进胃癌细胞粘附于PMCs。胃癌细胞与PMCs的粘附实验结果表明沉默LPPR4同时过表达Sp1可以逆转LPPR4基因沉默对胃癌细胞与PMCs之间粘附的抑制。结论:1.胃癌细胞来源的exosomes通过促进腹膜特异性PMN的形成,促进胃癌腹膜转移。2.胃癌细胞释放的Exosomal UBE3B,通过促进PMCs向CAFs的转化,进而形成腹膜特异性PMN,促进胃癌腹膜转移。3.LPPR4在胃癌腹膜转移组织高表达,是胃癌患者预后不良因素。4.LPPR4通过调控Sp1转录因子的表达进而调控integrinα表达,激活FAK、Src及AKT信号通路,活化靶基因MMP2,促进胃癌细胞的迁移、侵袭和粘附,进而促进胃癌的腹膜转移。5.Exosomal UBE3B和LPPR4可作为胃癌腹膜转移诊断和预测预后的潜在生物标志物。