喹诺酮类(Quinolones，QNs)属化学合成的抗菌药物，具有4-喹诺酮的基本结构，对细菌DNA回旋酶具有选择性抑制作用。由于其抗菌谱广、活性强、与其它抗菌药较少产生交叉耐药性、以及给药方便等优点，在不到半个世纪里先后开发了四代产品。近年来，氟喹诺酮类更以其对G~-和G~+的双重杀菌活性而在临床上被广泛应用。但是，在广泛应用的同时也观察到了QNs的各种药物不良反应，如消化系统、中枢神经系统不良反应、光毒性、心脏毒性、软骨毒性等。其中尤以关节软骨毒性正越来越受到人们的重视，因为大量的体内外试验都证明QNs对幼龄动物关节软骨具有毒性。这就提示QNs可能对未成年人也具有相同的毒性，此外，临床个案也报道未成年人服用QNs后引起关节疼痛肿胀，以及服药的妊娠动物胎儿与人工流产胎儿均观察到软骨细胞受损。从而限制了该类药物在儿童、青少年、孕妇、哺乳期妇女中的应用。但是，随着其他抗菌药物耐药菌株的出现，QNs对儿童所患的某些感染性疾病日益显现出治疗上的优越性。因此，对QNs软骨毒性机制的研究不仅有助于阐明其不良反应的根源，而且对正确评价其在儿童中的应用、指导对此类药物的结构改造以及防治其临床毒性等方面匀具有重要意义。近年来，尽管对QNs的软骨毒性问题进行了一系列的研究，但是其确切机制尚未阐明。普遍被接受的假设是：QNs通过与软骨细胞表面重要受体β1整合素竞争结合胞外镁离子而影响β1整合素的表达或功能从而致软骨细胞损伤。但是QNs是以什么方式致关节软骨细胞损伤，其损伤是否通过β1整合素介导，以及与β1整合素介导的哪些信号通路有关，目前还不清楚。因此，本研究以喹诺酮类代表药物氧氟沙星为研究对象，以藻酸微囊包被立体培养的幼龄兔关节软骨细胞为试验模型，从细胞凋亡、β1整合素功能、ERK／MAPK信号通路以及凋亡发生所涉及的信号通路等几个方面来深入探讨QNs致幼龄动物关节软骨损伤的可能机制。通过利用MTT试验、荧光双染凋亡定量试验、RT-PCR、Western blot、免疫共沉淀试验、DMB试验以及凋亡酶活性试验等，得到如下结果：1、单层培养和三维微囊培养软骨细胞的形态和功能比较。单层培养的软骨细胞呈现扁平、伸长的纤维状形态；而三维微囊培养的软骨细胞则保持正常生理状态下的球形形态。单层培养软骨细胞表达高水平的Ⅰ型胶原，而Ⅱ型胶原和蛋白多糖则表达很少；三维微囊培养软骨细胞的这些特征性产物表达则正好与单层培养相反，这些立体培养的软骨细胞表达高水平的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而Ⅰ型胶原表达量低。其表达模式与代表生理状态下软骨状态的组织块软骨细胞相似。以上数据表明，三维微囊培养的软骨细胞更能体现生理状态下软骨细胞的形态和功能；2、氧氟沙星以时间和浓度依赖的方式使软骨细胞存活率下降，且存活率的下降主要是由凋亡所致。此外，10βg／ml的氧氟沙星(与临床相关的浓度)可以明显诱导多聚二磷酸腺苷核糖酸多聚酶(Poly (ADP-ribose) polymerase，PARP)分解，Caspase-3激活以及DNA梯度片段形成，这些凋亡特征性指标进一步确证了凋亡的发生。因此，以上结果表明，氧氟沙星主要是通过凋亡的方式致关节软骨细胞损伤；3、10μg／ml的氧氟沙星在作用软骨细胞48时后使β1整合素受体、磷酸化的细胞外信号调控激酶1／2(phospho-extracellular signal-regulated kinase 1／2，phospho-ERK1／2)以及生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein 2，Grb 2)表达显著降低。但是却没有引起β1整合素的mRNA表达改变。此外，氧氟沙星使β1整合素受体不与激活的细胞内信号蛋白相互作用。在补充足够镁离子的条件下，氧氟沙星不能诱导软骨细胞凋亡以及使β1整合素受体表达下降。以上结果表明，从给药后48小时开始，氧氟沙星通过影响β1整合素受体功能，抑制ERK／促分裂原活化蛋白激酶(ERK／Mitogen-activated protein kinase，ERK／MAPK)信号通路而引起软骨细胞凋亡；4、10μg／ml的氧氟沙星可以激活凋亡酶Caspase-8，但是对Caspase-8的抑制不影响氧氟沙星对phospho-ERK1／2和β1整合素受体蛋白表达的影响。Caspase-9特异性抑制剂zLEHD-fmk和Caspase-8特异性抑制剂zIETD-fmk以浓度依赖的方式减弱氧氟沙星诱导的软骨细胞凋亡和Caspase-3激活；Caspase-8特异性抑制剂zIETD-fmk明显抑制氧氟沙星诱导的Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3活化，而Caspase-9特异性抑制剂zLEHD-fmk则仅仅抑制Caspase-9和Caspase-3的活化。以上结果表明，在作用48小时后，氧氟沙星通过影响β1整合素受体功能而激活Caspase-8，诱导软骨细胞凋亡；5、10μg／ml氧氟沙星也以浓度依赖的方式使细胞色素c从线粒体转移到胞浆以及线粒体膜电位降低，而Caspase-8特异性抑制剂则可以完全抑制以上效应。此外，氧氟沙星以浓度和时间依赖的方式使Bcl-2家族蛋白Bax、tBid和p53表达增加，而VDAC、Bcl-2和Bcl-xL的表达则不受影响。以上结果表明，氧氟沙星引起的软骨细胞凋亡主要是通过Caspase-8依赖的线粒体通路。综上所述，本研究的结果表明了氧氟沙星主要是通过依赖于Caspase-8的线粒体凋亡通路诱导软骨细胞凋亡而致关节软骨损伤；而凋亡的发生是由于β1整合素的功能改变所致，与β1整合素的表达无关。初步推测其机制可能为：在氧氟沙星作用48小时后，由于氧氟沙星使β1整合素受体的构象改变，不能与胞外相应的配体结合，从而影响了其正常功能。因此，未结合配体的整合素受体聚集，随后引起Caspase-8的募集以及ERK／MAPK信号通路的抑制，最后诱导软骨细胞凋亡。以上这些结论为首次报道，它初步阐明了QNs软骨毒性不良反应的根源，将有助于对其他QNs的软骨毒性研究提供理论基础，在对正确评价其在儿童中的应用、指导对此类药物的结构改造以及防治其临床毒性等方面匀具有重要意义。