研究背景哺乳动物骨骼系统由骨组织与软骨组织组成,主要起源于三种不同胚层的细胞,通过两种骨化方式发育而成:即膜内成骨和软骨内成骨。其中,软骨内成骨是躯干骨和四肢骨的主要成骨方式;在软骨内成骨的过程中,软骨细胞的增殖、成骨细胞的分化及血管的生成紧密协调并介导软骨组织到骨形成的转变,软骨发育异常或骨形成障碍均能导致骨发育不良、矮小畸形等。在骨发育过程中,成骨过程受到包括转录因子、细胞因子及激素等的严密调控。其中,印度刺猬因子（Indian hedgehog,Ihh）是调控复杂的软骨内成骨的重要细胞因子,主要表达于前肥大软骨细胞、部分肥大软骨细胞及成骨谱系细胞;目前研究已阐明人类IHH基因的突变是A1型短指畸形（brachydactyly type A1）和肢端股骨头发育不良（acrocapitofemoral dysplasia）等遗传性疾病的关键致病因素。小鼠遗传学研究进一步表明软骨细胞来源的印度刺猬因子通过调控软骨细胞的增殖、肥大分化,参与成软骨祖细胞向成骨细胞前体细胞的定向,从而维持生长板的正常发育及软骨内成骨。而成骨细胞内源性的印度刺猬因子调控成骨细胞分化及骨形成作用的相关研究尚未见报道,其可能的分子机制仍有待阐明。此外,目前研究也表明骨形态发生蛋白家族（BMPs）通过介导BMP/SMAD通路参与成骨分化及骨形成,是调控成骨细胞增殖、分化及骨形成的关键细胞因子,其中配体Bmp2/4（骨形态发生蛋白家族的重要成员）是在早期骨形成中起重要作用的分泌蛋白,主要表达于软骨膜及骨膜成骨细胞,通过与受体结合诱导下游Smad1/5/8复合物的磷酸化,进而激活矮小相关转录因子Runx2的转录,Runx2是调控成骨细胞的分化以及激活下游成骨相关基因表达的关键转录因子。最近的研究表明,Bmp2/Smad信号通路作用于Ihh的下游,Ihh基因的缺失或低表达可导致Bmp2的表达明显下调。因此,明确成骨细胞表达的印度刺猬因子在成骨中的作用,以及理解其影响成骨细胞行为的机制,将有助于开发治疗骨发育不良和侏儒畸形的新疗法。研究目的:（1）获取Sp7-i Cre转基因小鼠,Ihhfl/fl基因打靶小鼠及Rosa26-ZSGreen基因报告小鼠,通过对胫骨组织的绿色荧光蛋白检测及Sp7,Ihh的免疫组化及原位杂交,动态观察早期发育过程中Sp7介导的Cre重组酶在胫骨组织中的表达情况,Sp7和Ihh的m RNA与蛋白表达情况,验证骨发育过程中Sp7、Cre重组酶和Ihh在胫骨软骨膜/骨膜成骨细胞的共定位表达;（2）Sp7-i Cre;Ihhfl/fl基因工程小鼠的培育和鉴定,并利用该体内特异性敲除Ihh的小鼠模型在体内研究Ihh基因对骨形成的调控作用;（3）利用体外实验研究Ihh调控成骨细胞增殖及分化的作用,并初步探究成骨细胞的Ihh基因调控成骨细胞分化及矿化的潜在分子机制。总之,本研究利用Cre/lox P重组酶系统在体条件性敲除Ihh基因的模式动物及谱系示踪技术,结合体内组织学研究及体外细胞实验,从整体、细胞及分子层面阐明成骨细胞中的印度刺猬因子调控细胞分化及骨形成的作用,并初步探究其潜在的作用机制。研究方法:（1）获取基因型为Sp7-i Cre的转基因小鼠及Ihhfl/fl基因打靶小鼠;培育Sp7+成骨细胞特异性敲除Ihh的Sp7-i Cre;Ihhfl/fl小鼠,取同窝Ihhfl/fl小鼠为实验对照组。具体方法如下:a.提取鼠尾组织基因组DNA并通过PCR扩增、凝胶电泳鉴定两组小鼠的基因型;b.在早期发育过程中,利用Rosa26-ZSGreen报告小鼠示踪Sp7启动子介导的Cre重组酶的动态表达;通过免疫组化及原位杂交观察内源性Sp7及Ihh的基因与蛋白动态表达情况;c.提取E18.5胚胎小鼠的胫骨、颅顶骨以及肝脏、肾脏、肺脏、心脏组织的RNA,通过RT-q PCR检测不同组织Ihh基因的表达情况,检测Ihh基因敲除的组织特异性及敲除效率;d.观察Ihh基因敲除的新生小鼠与对照组小鼠的大体表型,测量两组新生小鼠的身长及体重;通过X线检查、全骨架染色及组织学染色,观察两组小鼠的大体表型,尤其骨表型。（2）在小鼠的早期发育过程中,利用特异性敲除印度刺猬因子的Sp7-i Cre;Ihhfl/fl小鼠模型,在体研究Sp7+成骨细胞的Ihh基因对早期骨形成的调控作用。具体方法如下:a.收集胚胎期13.5（E13.5）,14.5（E14.5）,16.5（E16.5）,及18.5（E18.5）的Ihh基因敲除小鼠与同窝Ihhfl/fl小鼠,通过全骨架染色,研究早期发育过程中的小鼠骨生长及基质矿化的动态变化;b.利用E14.5,E16.5,E18.5小鼠的胫骨组织切片,通过番红O-固绿染色分析胫骨组织的形态学特征,进一步通过von Kossa（钙盐染色法）与Masson三色染色法分别观察早期骨发育中的胫骨组织矿化和新生骨形成的特征;c.利用各阶段小鼠的胫骨组织切片,通过免疫组化观察矮小相关转录因子（Runx2）、I型胶原（Col1α1）、骨保护素（Opg）和骨钙素（Ocn）的表达情况;同时观察E18.5的两组小鼠血管生成相关标志物Vegfa和CD31的表达情况;d.利用各阶段小鼠的胫骨组织切片行II型胶原（Col2α1）,X型胶原（Col10α1）的免疫组化,检测增殖指标PCNA的表达;通过原位细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL）观察细胞的凋亡情况;e.分别提取E18.5的对照组及敲除组小鼠胫骨组织总RNA并检测胫骨组织的成骨相关基因的相对表达量。（3）体外实验验证敲除Ihh对原代成骨细胞增殖、分化及矿化的影响,进一步探究Ihh调控成骨细胞功能的作用机制,验证Ihh是否通过下游的BMP2/SMAD/RUNX2通路发挥调控成骨细胞分化的作用。具体方法如下:a.利用E14.5,E16.5,E18.5小鼠的胫骨组织切片,行Anti-BMP2免疫组织化学染色,蛋白层面观察敲除Ihh后Bmp2的表达情况;提取E18.5胫骨组织总RNA,通过实时定量PCR在基因层面观察敲除Ihh后的胫骨组织Bmp2及下游的SMAD1,SMAD5的表达量;提取原代成骨细胞,行RT-q PCR检测敲除Ihh组与对照组原代细胞的Bmp2的表达量;b.通过CCK-8及结晶紫染色实验,观察两组细胞的增殖情况;两组细胞诱导分化7,14天后,分别行ALP染色,von Kossa（钙盐染色法）和ARS染色法观察细胞分化及矿化;进一步提取两组细胞总RNA,通过RT-q PCR检测成骨相关基因的表达量;c.提取两组小鼠的原代成骨细胞,分别给予成骨诱导分化培育基+rh BMP2或单纯诱导分化培养基进行7,14天的诱导分化,行ALP染色,von Kossa（钙盐染色法）和ARS染色法观察细胞分化及矿化;提取细胞总RNA及总蛋白,通过RT-q PCR及Western blot检测成骨相关基因在基因与蛋白水平上的表达量。研究结果:（1）成功繁育出基因型分别为Sp7-i Cre+;Rosa26-ZSGreen及Sp7-i Cre+;Ihhfl/fl;Rosa26-ZSGreen的小鼠并行PCR鉴定基因型。a.胫骨冰冻切片荧光图像显示在E14.5时,软骨膜和骨领中存在GFP阳性细胞,到E18.5,这些细胞大部分出现在骨膜和骨小梁中;Sp7的免疫组化染色结果显示Sp7和GFP均主要表达于成骨谱系细胞;Ihh的免疫组化及原位杂交结果表明Ihh在早期发育中不仅在前肥大软骨细胞表达,同时也在骨膜及骨小梁的Sp7阳性细胞中表达。b.通过传统PCR扩增鼠尾或脚趾组织基因组DNA,证明两组基因型小鼠的成功构建;另外,Sp7-i Cre;Ihhfl/fl小鼠的出生符合孟德尔比例,但在出生后不久即死亡（由于肋骨发育不良和胸腔结构软化导致呼吸衰竭）。新生小鼠表现为短肢及矮小畸形为特征的全身骨发育不良,但趾（指）间关节分割正常;进一步定量分析结果确认敲除小鼠体重降低,体长明显变短（P＜0.05）;X线结果显示敲除Ihh的小鼠骨矿物质密度和骨体积明显减少;全骨架染色进一步表明除了长骨发育不良,其他骨骼,如肋骨、锁骨、椎骨、胸骨、下颌骨的尺寸也较小,而颅骨矿化程度低,矢状缝更宽也表明了膜内成骨的受损。c.两组小鼠胫骨总RNA的RT-q PCR结果表明敲除组小鼠胫骨Ihh基因明显缺失（约下降90%）;颅骨Ihh水平也显著降低约50-60%,此外,肝、肺、心脏和肾脏中Ihh m RNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）,证明骨组织中Ihh基因的特异性敲除。d.H＆E染色结果表明敲除组小鼠的生长板缩短且紊乱,静止区、增殖区及肥大区均变短,同时,也观察到骨化显著减少,骨膜宽度明显变窄;von Kossa及Masson染色显示,突变小鼠的骨髓腔缩短并且矿化局限于胫骨中心,并无骨小梁和皮质骨的形成。（2）早期发育过程中,敲除Sp7+成骨细胞的Ihh延迟骨生长及基质矿化,导致小鼠严重的骨发育不良及异常的生长板形态,但并不影响关节的正常分割。a.不同时间点的两组小鼠大体表型及全骨架染色表明Ihh基因的敲除延缓了骨生长与基质的矿化,而指（趾）间关节分割正常;b.不同时间点小鼠的番红O-固绿染色,von kossa染色及Masson染色结果表明敲除组小鼠的皮质骨和小梁骨形成受损,并影响生长板正常形态的形成;免疫组化结果证明骨形成所必需的关键转录因子Runx2与Sp7,及骨基质蛋白（I型胶原,骨保护素,骨钙素）的表达减少;E18.5小鼠胫骨组织的RT-q PCR结果进一步表明成骨相关基因的表达量减少;c.血管生成相关标志物Vegfa和CD31的免疫组化及RT-q PCR结果表明E18.5突变小鼠胫骨的假定初级骨化中心Vegfa和CD31的表达显著降低;另外,免疫组化及荧光定量PCR结果表明软骨细胞标志物Col2α1和Col10α1的表达模式改变且表达减少,PCNA的免疫组化染色及TUNEL染色结果进一步表明Ihh的敲除导致软骨细胞增殖减少,凋亡增加。（3）体外实验表明敲除Ihh抑制原代成骨细胞的增殖,分化及矿化,并且Sp7+成骨细胞的Ihh可能通过BMP2/SMAD/RUNX2信号通路发挥促成骨作用。a.利用E18.5的两组小鼠颅顶骨组织可以分离并提取足够量的细胞进行体外细胞实验,且细胞形态基本正常,CCK-8检测和结晶紫染色结果显示,Ihh敲除小鼠原代成骨细胞生长相对缓慢,增殖能力受到抑制;而在生长培养基中分别培养7天及14天的Ihh敲除小鼠原代成骨细胞与正常成骨细胞相比,Ihh的表达分别降低了53%和63%;在诱导分化培养基诱导分化7天及14天,Ihh的失活也抑制成骨细胞的矿化;RT-q PCR的结果进一步表明成骨相关基因m RNA表达水平显著降低。b.BMP2免疫组化结果显示,与同窝Ihhfl/fl小鼠相比,E14.5突变小鼠软骨膜成骨细胞减少并且Bmp2表达降低,且在E18.5时骨膜和骨小梁区Bmp2的表达也减少;RT-q PCR定量分析在基因水平证实突变体小鼠胫骨Bmp2和Runx2的表达显著降低。c.诱导分化过程中,敲除组细胞与正常组细胞分别给予成骨诱导分化培育基+rb BMP2或成骨诱导分化培养基,诱导分化14天后进行ALP染色,结果表明成骨细胞碱性磷酸酶活性降低,von Kossa及ARS染色观察到细胞矿化能力受到抑制;经此四种处理后的细胞RT-q PCR及Western blot检测结果在基因与蛋白水平上证明成骨相关基因表达的减少,并且敲除Ihh减弱BMP2/SMAD/RUNX2通路,而BMP2重组蛋白挽救后的结果表明敲除组原代成骨细胞经rh BMP2治疗后恢复或部分恢复了成骨和矿化功能。研究结论:本研究成功构建一种新的在体敲除Ihh基因的小鼠模型(Sp7-i Cre;Ihhfl/fl),首次在体内特异性敲除Sp7表达细胞中的Ihh基因,揭示了Sp7+成骨细胞的Ihh基因调控细胞分化及骨形成的重要作用。该基因敲除小鼠以短肢、矮小畸形为特征,表现为全身骨发育不良,尤其皮质骨和小梁骨形成障碍,生长板的异常形态,但并不影响趾（指）间关节分割正常;体外实验进一步表明Sp7+成骨细胞中的Ihh基因可能通过BMP2/SMAD/RUNX2信号通路调控成骨细胞分化、矿化及骨形成。