目的:多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）是一种常见的浆细胞肿瘤,导致恶性浆细胞的增殖和单克隆免疫球蛋白的过量产生。以硼替佐米（Bortezomib,BTZ）为代表的蛋白酶体抑制剂（Proteasome Inhibitor,PI）一直是MM的主要治疗药物,但是,大多数骨髓瘤患者最终会出现耐药,导致疾病复发。探讨MM硼替佐米耐药的分子机制,寻找硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤患者的可能治愈方案,对提高MM患者硼替佐米治疗敏感性和生存率有着重要的意义。为了找到BTZ耐药的预测性生物标志物,有必要使用原始MM样本和高通量测序数据进行进一步研究。因此,本研究利用生物信息学的方法,挖掘MM中潜在的耐药分子靶点,并利用基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库数据及临床样本数据验证其可行性,然后初步探讨靶基因在MM细胞增殖、凋亡和硼替佐米耐药中的作用机制,进而为临床治疗多发性骨髓瘤提供新的思路。方法:1.从GEO数据库下载微阵列数据集GSE9782,应用GEO2R在线分析工具筛选硼替佐米敏感与耐药MM患者的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）。应用DAVID数据库对DEGs进行GO功能,KEGG途径和REACTOME通路富集分析。应用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction,PPI）网络,在Cyto Hubba中通过Betweenness、Bottleneck、Stress三种方法进一步筛选Hub基因。通过Kaplan-Meier plotter对Hub基因进行生存分析以及结合文献复习筛选并鉴定目标基因NAMPT。并从GEO数据库下载3个微阵列数据集GSE6477、GSE31162、GSE24080的基因表达数据及临床数据,初步验证所选目标基因NAMPT在MM中的表达及与临床特征、预后的相关性。使用另一个独立的MM微阵列数据集GSE19784进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）,探讨NAMPT参与MM细胞功能的可能机制。2.采集2018年12月-2020年10月在山西医科大学第二医院血液科住院的85例MM患者及15例健康造血干细胞移植供者的骨髓样本以及详细的临床资料。采用q RT-PCR和Western blot方法检测MM患者与健康供体的骨髓单个核细胞NAMPT m RNA和蛋白的表达情况,探讨NAMPT基因表达与临床病理特征、疗效的相关性,采用Kaplan-Meier方法分析NAMPT对无进展生存（Progression Free Survival,PFS）和总生存（Overall Survival,OS）的影响,并进行单因素和多因素生存分析。3.以正常骨髓单个核细胞为对照,采用q RT-PCR和Western blot方法检测多发性骨髓瘤细胞系MM1R、MM1S、U266、RPMI-8226中NAMPT m RNA和蛋白表达水平,选择NAMPT表达水平最高的U266细胞系作为研究对象。将Si RNA-NAMPT和阴性对照Si RNA分别转染到U266细胞中,在U266细胞中稳定敲除NAMPT,采用p Max GFP载体评估U266细胞的转染成功率,采用Western blot方法检测稳定敲除NAMPT的U266细胞中NAMPT蛋白水平,验证基因敲除效果。采用CCK8法检测转染后U266细胞的增殖情况,流式细胞术检测NAMPT稳定敲除和未敲除情况下的细胞凋亡率。将Flag-NAMPT重组质粒及空载体Flag分别转染到U266细胞中,在U266细胞中稳定过表达NAMPT,Western blot法分析其过表达效果。采用CCK8法检测过表达NAMPT后U266细胞的增殖情况,流式细胞术检测NAMPT稳定过表达和未过表达情况下的细胞凋亡率。从正反两个方面证实NAMPT对MM细胞增殖、凋亡的影响。4.利用JASPAR数据库对NAMPT上游基因组序列进行检测,在NAMPT启动子中发现一个潜在保守的XBP1结合区。通过染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）实验证实XBP1基因和NAMPT启动子基因片段存在特异性结合。在U266细胞中分别敲除和过表达XBP1基因,Western blot法分析XBP1基因敲除和过表达效果,采用q RT-PCR法检测XBP1基因敲除和过表达前后NAMPT m RNA水平,从而探讨NAMPT的异常表达在转录水平的受调控机制。5.分别将XBP1-Si RNA、NAMPT-Si RNA及阴性对照Si RNA转染到U266细胞中培养24h,再用硼替佐米处理24h,采用CCK8法测定各组细胞增殖情况。另外,以二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）为阴性对照组,使用IRE1α抑制剂MKC3946预处理U266细胞4h,再用硼替佐米处理24h,采用CCK8法测定细胞增殖情况。采用RT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因BCL2和BAX m RNA和蛋白表达量,采用Caspase-3/7分析试剂盒对各组进行Caspase-3/7活性分析。结果:1.应用GEO2R在线工具筛选出GSE9782数据集中硼替佐米敏感与耐药MM患者之间的DEGs,包括112个上调基因和89个下调基因。对DEGs进行GO功能、KEGG和REACTOME通路富集分析。GO功能包括生物过程（Biological Process,BP）、细胞成分（Cellular Component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）3个部分。BP分析提示DEGs在翻译起始,m RNA降解代谢过程,靶向细胞膜的SRP依赖的共翻译蛋白中显著富集。CC主要富集到胞质核糖体,核糖体亚基和胞质部分。主要参与的MF包括核糖体结构成分,翻译起始因子活性,翻译因子活性,RNA结合,细胞粘附等。KEGG途径发现DEGs在核糖体生成,氧化磷酸化,RNA转运,NF-k B信号通路,TNF信号通路和细胞凋亡中显著富集。REACTOME通路富集分析提示表达上调的DEGs在MM耐药中发挥了重要作用。应用STRING数据库构建了由201个节点和960条边组成的PPI网络,进一步利用Betweenness,Bottleneck and Stress方法确定了7个Hub基因,包括RPS27A、RPS16、COX7C、LCK、NAMPT、PTEN、CXCL8。Hub基因生存分析显示,高表达NAMPT为MM患者OS的不良预后因素。结合PPI分析、生存分析及文献复习,最终鉴定NAMPT为本研究的目标基因。通过综合微阵列数据集GSE6477、GSE31162、GSE24080的大数据分析,结果显示,相对于正常浆细胞,新诊断MM细胞中NAMPT的表达显著升高（P＜0.001）。NAMPT在复发MM细胞中的表达明显高于新诊断MM细胞（P＜0.001）。NAMPT的表达与β2-微球蛋白（P=0.046）、血清乳酸脱氢酶（P=0.012）和磁共振成像确定的局灶性病变数量（P=0.008）显著相关。与NAMPT高表达组患者相比,NAMPT低表达组患者的无事件生存率（P=0.037）和总生存率（P=0.009）更高,并且NAMPT表达是MM患者PFS和OS的独立预后因素（分别P=0.006,P=0.020）。GSEA结果显示,NAMPT可能通过m TORC1信号通路影响MM细胞的增殖。2.新诊断和复发MM患者骨髓NAMPT m RNA表达水平均明显高于健康供体（P＜0.001）。复发MM患者NAMPT m RNA表达明显高于新诊断MM患者的表达量（P＜0.001）,与NAMPT蛋白表达结果一致。ISS III期、乳酸脱氢酶和C反应蛋白水平升高、P53缺失和骨髓瘤细胞比例较高等不良临床病理特征的患者NAMPT表达明显上调（P＜0.001）。相对于CR组,PR、进展和复发组患者中NAMPT m RNA表达均明显上调（P＜0.001）。NAMPT高表达患者的中位PFS（14.9个月）明显短于NAMPT低表达组（27个月,P＜0.001）。NAMPT高表达组患者的中位OS（27.3个月）显著短于NAMPT低表达组（39.1个月,P=0.048）。单因素和多因素分析显示NAMPT高表达患者PFS和OS均明显低于低表达组。3.多发性骨髓瘤细胞系MM1R、MM1S、U266、RPMI-8226中NAMPT m RNA和蛋白水平较正常骨髓细胞均显著升高（P＜0.001）,且在U266细胞中表达量最高。基因敲除效果显示超过80%的U266细胞在转染后24h表达绿色荧光信号,表明转染成功。与Si-NC组相比,Si-NAMPT组细胞中NAMPT蛋白表达水平显著降低（0.89±0.06 vs 0.22±0.06,t=-24.42,P＜0.001）。与Si-NC组比较,Si-NAMPT组转染24、48、72h时显著抑制U266细胞增殖（24h:1.03±0.11 vs 0.62±0.08;48h:1.62±0.11 vs0.78±0.06;72h:2.37±0.18 vs 1.23±0.14）,差异有统计学意义（分别P=0.006,P＜0.001,P=0.001）。与Si-NC组相比,Si-NAMPT组在转染48h时U266细胞凋亡率明显升高[（35.43±1.67）%vs（53.42±0.25）%],差异有统计学意义（t=4.41,P＜0.001）。提示,稳定敲除NAMPT可抑制U266细胞的增殖,诱导细胞凋亡。与Flag-NC组比较,Flag-NAMPT组U266细胞中NAMPT蛋白表达水平明显升高（0.12±0.08 vs1.18±0.07,t=16.42,P＜0.001）。随着作用时间的延长,与Flag-NC组相比,Flag-NAMPT组细胞增殖明显升高（24h:1.13±0.05 vs 1.52±0.09;48h:1.60±0.24 vs 2.67±0.07;72h:2.38±0.07 vs 4.93±0.24）,差异具有统计学意义（分别P=0.003,P=0.002,P＜0.001）。与对照组细胞凋亡率相比,Flag-NAMPT组细胞凋亡率明显减少[（32.77±1.39）%vs（21.92±1.56）%],差异有统计学意义（t=-8.99,P=0.001）。结果表明,与敲除NAMPT基因结果相反,过表达NAMPT可促进U266细胞增殖,抑制细胞凋亡。4.XBP1在转录水平调控NAMPT的表达。利用JASPAR数据库对NAMPT的基因组上游序列进行分析,在NAMPT的启动子区域1913bp～1926bp处发现一个潜在保守的XBP1结合位点。Ch IP实验结果显示,在U266细胞中内源的XBP1能和NAMPT基因上游XBP1结合位点特异性结合。与Flag-NC组比较,Flag-XBP1组U266细胞中XBP1蛋白表达水平显著升高,Flag-XBP1能够明显上调NAMPT m RNA水平（1.00±0.00 vs 6.13±0.41,t=21.368,P＜0.001）。XBP1的稳定敲除导致U266细胞中NAMPT m RNA水平明显下调（1.00±0.00 vs 0.32±0.05,t=-20.52,P＜0.001）。结果提示,在U266细胞中NAMPT的表达在转录水平受到XBP1的调控。5.抑制IRE1α-XBP1-NAMPT轴增加U266细胞对硼替佐米的敏感性。用硼替佐米处理XBP1或NAMPT稳定敲除的U266细胞后细胞增殖率均明显下降,分别为（62.73±3.62）%和（52.70±4.08）%。细胞内BCL2/BAX的比例对决定细胞凋亡的敏感性起到重要作用。Caspase-3/7的活化也可视为U266细胞对硼替佐米治疗敏感性的效应。与Si-NC组相比,稳定敲除XBP1、NAMPT的U266细胞在硼替佐米处理后BAX m RNA和蛋白水平明显升高,BCL2 m RNA和蛋白水平明显下调,Caspase-3裂解度显著,Caspase-3/7活性急剧增加（P＜0.001）。另外,以二甲基亚砜（DMSO）为阴性对照组,使用MKC3946预处理U266细胞4h,再用硼替佐米处理24h后,细胞增殖率显著下降,为对照组的（61.81±5.26）%,BAX m RNA和蛋白水平明显升高,BCL2 m RNA和蛋白水平明显下调,Caspase-3裂解度显著,Caspase-3/7活性急剧增加（P＜0.001）,与上述结果一致。提示,抑制IRE1α-XBP1-NAMPT轴诱导U266细胞对硼替佐米更加敏感,更易凋亡。结论:1.NAMPT高表达可能导致MM患者硼替佐米耐药,与MM患者的不良预后有关,有望作为MM的耐药和预后生物标志物。2.NAMPT在新诊断和复发MM患者中表达水平明显高于正常人,其上调与MM患者不良的临床特征、疗效和预后相关,是MM的独立预后危险因素。3.NAMPT高表达可以促进MM细胞增殖,抑制细胞凋亡。从机制上讲,在U266细胞中NAMPT受IRE1α-XBP1信号通路的转录调控。稳定敲除NAMPT的表达或阻断IRE1α-XBP1通路可显著提高U266细胞对硼替佐米的敏感性。